تصنيع الرغوة المشتقة من المصفوفة خارج الخلية عن طريق التجميد بالتجميد: إجراء لتوليد سقالات بيولوجية من ECM للأنسجة منزوعة الخلايا

الملخص

المصدر: Kornmuller، A. et al. تصنيع الرغاوي المشتقة من المصفوفة خارج الخلية والناقلات الدقيقة كثقافة الخلايا الخاصة بالأنسجة. (2017)

يصف هذا الفيديو طريقة تصنيع الرغوة النقية المشتقة من ECM دون الحاجة إلى التشابك الكيميائي. تجد هذه الرغاوي المشتقة من ECM تطبيقات كنماذج متقدمة ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا في المختبر أو كسقالات حيوية مؤيدة للتجديد.

البروتوكول

فئة

1. تصنيع الرغوة المشتقة من ECM

1. قم بإعداد تعليق ECM المتجانس عن طريق تشتيت مسحوق ECM الناعم في محلول عازل واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع تحريك مستمر عند 120 دورة في الدقيقة حتى يصبح التعليق دافئا.
2. تمييع معلق ECM في 0.2 M أسيتيك حمضي إلى التركيز المطلوب.
   ملاحظه: اعتمادا على مصدر ECM ، يمكن تحضير رغاوي مستقرة في حدود 10-100 مجم / مل ، مع 15-50 مجم / مل كنطاق موصى به ل DAT و DDT و DLV. عادة ما تكون الرغوة المصنعة بتركيزات أعلى أقل مسامية قليلا ولكنها أكثر استقرارا في الثقافة وأسهل في التعامل معها.
3. باستخدام حقنة سعة 3 مل بإبرة 18G لمنع تكوين الفقاعات في تعليق ECM ، املأ القالب المطلوب بتعليق ECM. لتصنيع رغاوي DAT و DDT و DLV ، قم بتوزيع 400 ميكرولتر من معلق ECM 35 مجم / مل في صفيحة معالجة بزراعة الخلايا المكونة من 48 ب><ئرا. ملاحظه: سيحدد شكل القالب المحدد وحجم تعليق ECM هندسة الرغوة الناتجة.
4. قم بتغطية القوالب وتجميدها طوال الليل عن طريق وضعها في فريزر -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
   ملاحظه: قد تؤثر درجة حرارة التجمد على مسامية الرغوة. من المتوقع أن تكون المسام أكبر عندما يتم تجميد العينات عند -20 درجة مئوية مقارنة ب -80 درجة مئوية بسبب تكوين بلورات جليدية أكبر. لتصنيع الرغوة ذات الهيكل المسامي الموحد ، تأكد من أن القالب ليس ملامسا لسطح موصل لمنع التبريد الاتجاهي.
5. ضع القوالب التي تحتوي على العينات المجمدة في قارورة مجففة. قم بتوصيل قارورة المجفف بالتجميد بنظام مجفف التجميد في المختبر وجففها لمدة 24 ساعة < / > ملاحظة: من المهم أن تظل العينة مجمدة قبل التجميد بالتجميد.
6. قم بتخزين الرغوة المجففة بالتجميد في مجفف لحين الحاجة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الميزان التحليلي سارتوريوس CPA225D أنابيب الطرد المركزي (15 مل) سارستيدت 62.554.205 أنابيب الطرد المركزي (50 مل) سارستيدت 62.547.205 الكولاجين من العرقوب البقري
الوتر (غير قابل للذوبان) سيغما [ك9879] أو كولاجين غير قابل للذوبان مماثل
مصدر; يمكن استخدامها ك
بديل لمنزوعة الخلايا
مناديل لتصنيع الرغوة و
الناقلات الدقيقة ديسيكاتير فيشر ساينتيك 8624426 لوحدة التحكم في المحرك المجففة بالتجميد و
تخزين السقالات الحيوية قارورة ديوار فيشر ساينتيك 10-196-6 شكل منخفض ؛ نطاق حجم 250-500 مل الماء المقطر المزدوج (ddH_{2} O) من Barnstead GenPure xCAD
نظام تنقية المياه D-PBS (مخزن الفوسفات
محلول ملحي) Wisent 311425125 ECM (المصفوفة خارج الخلية) معزول عن الدهون البشرية
الأنسجة ، أدمة الخنازير أو الخنازير
عضلة القلب ، كما هو موضح في Flynn
et al. 2010 ، Reing et al. 2010 ، و
Wainwright et al. 2010 (المرجع # 28 ، 8،
32) ملقط VWR 37-501-32 لنقل الرغوة فريزر (-20 درجة مئوية) VWR 97043-346 فريزر (-80 درجة مئوية) الترمو: العلمية EXF40086A قوارير زجاجية فيشر ساينتيك 03-339-26 د لتخزين المجفف بالتجميد
ECM النيتروجين السائل للرش الكهربائي مجفف التقويم لابكونكو 7750021 المنطقة الحرة4.5 18 جرام إبرة VWR ج ABD305185 للاستغناء عن تعليق ECM
في قوالب شاكر حاضنة مداري سكيولوجيكس 832010089999 التحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) الماصات المصلية (10 مل) سارستيدت 86.1254.001 الماصات المصلية (25 مل) سارستيدت 86.1685.001 كلوريد الصوديوم بيو شوب 7647-14-5 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة بيو شوب 10049-21-5