تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير قطرات المصفوفة شبه الصلبة (< 1 دقيقة لكل لوحة)
- ضع صفيحة زجاجية مبردة مسبقا على كتلة ثلجية أسفل مجهر التشغيل. تأكد من بقاء حصة المصفوفة على الجليد في جميع الأوقات.
- ضع قطرة مصفوفة سعة 1.5 ميكرولتر في كل زاوية من الزوايا الأربع للوحة ذات القاع الزجاجي باستخدام ماصة دقيقة 2 ميكرولتر أو 10 ميكرولتر ، مع ترك مسافة لا تقل عن القطرة نفسها من حافة البئر الزجاجي.
- ضع طرف الماصة مباشرة على الزجاج بزاوية 45 درجة. ماصة المصفوفة ببطء. ابتعد ببطء عن القاع الزجاجي بعد تعشيق المصفوفة على اللوحة.
ملاحظه: يجب أن يخلق التوتر السطحي بين المصفوفة والزجاج نصف كرة أرضي مثاليا في كل مرة.
- توقف عن سحب العينات قبل أن يصبح الطرف فارغا مباشرة لأن الحقن غير المقصود للهواء في قطرة المصفوفة يجعل قطر قطرة المصفوفة أكبر بكثير ويصعب إزالته.
ملاحظه: يسهل استخدام عقرب الثواني لتثبيت عقرب سحب العينات وضعه بشكل أكثر دقة.
< p class = "jove_title" >
2. إدخال DRG في قطرات المصفوفة شبه الصلبة (< 2 دقيقة لكل لوحة)
- اترك اللوحة مع قطرات المصفوفة لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (~ 1 دقيقة). يؤدي هذا إلى تقوية المصفوفة قليلا ، مما يسهل وضع DRG بدقة.
- اغرف (لا تمسك) DRG برفق باستخدام ملقط مجهري مغلق في اليد اليسرى. مرة أخرى ، تسهل الخلفية الداكنة مقابل DRG الأبيض الصغير التصور. انقل DRG إلى طرف إبرة 21G في اليد اليمنى. سيؤدي هذا النقل إلى ترك الوسائط المتبقية على الملقط.
- أدخل DRG برفق في منتصف قطرة المصفوفة باستخدام إبرة 21G (الشكل 1). في معظم الأحيان ، سيتم تحرير DRG بسهولة في المصفوفة ومن ثم يمكن وضعه مركزيا باستخدام الإبرة.
- إذا التصقت DRG بالإبرة ، فاستخدم الملقط المجهري لدفع DRG بعيدا عن الإبرة إلى قطرة المصفوفة. قم بإزالة الوسائط الزائدة من الملقط المجهري بمسح معملي.
ملاحظه: سيؤدي إدخال الوسائط إلى المصفوفة إلى تغيير قطر الفحص وحجمه واتساقه. توفر كتلة الجليد ذات الكتابة الملونة أو الملونة تباينا في الخلفية ، مما يسهل تصور هذه العملية الدقيقة.
- بعد أن تحتوي اللوحة على جميع DRGs الأربعة ، قم بإجراء فحص نهائي للتأكد من أن DRG في وسط قطرة المصفوفة. قم بإجراء التعديلات حسب الحاجة باستخدام إبرة 21G.
- انقل اللوحة المكتملة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى ترسيخ المصفوفة شبه الصلبة وتثبيت DRG في موضعه.
- كرر هذه العملية لجميع DRGs. ضع قطرات مصفوفة فارغة بدون DRG كعنصر تحكم سلبي.
- أضف 4 مل من DMEM مع وسائط FBS بنسبة 10٪ إلى كل لوحة ذات قاع زجاجي بعد إكمال جميع الألواح وتعريضها للحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على الأقل. ضع اللوحة بزاوية طفيفة وأضف الوسط ببطء ، بحيث تتلامس تدريجيا مع وحدات المصفوفة DRG.
ملاحظه: إذا تمت إضافة الوسيط بسرعة كبيرة أو بقوة ، يمكن إزاحة المصفوفة و / أو DRG.
- قم بتخزين المقايسات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة
ملاحظه: سيظهر الفحص الدوري للمقايسات نموا محيطيا للعصبيات باتجاه حافة المصفوفة (الشكل 2). عندما تكون الخلايا العصبية أكبر من ثلاثة أرباع الطريق إلى المصفوفة ، فمن المناسب أن تصفيح الخلايا.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير خلايا سرطان الرأس والرقبة
ملاحظة: يمكن استخدام خطوط الخلايا بخلاف خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة في هذا التصميم التجريبي.
- الحفاظ على خطوط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في DMEM مع 10٪ FBS في القوارير المفضلة أو أطباق الاستزراع في حاضنة 37 درجة مئوية. لتحضير الخلايا للتجريب ، قم بشفط كل الوسائط من قارورة الثقافة أو الطبق واغسلها مرتين باستخدام PBS. قم بتعليق الخلايا عن طريق إضافة كمية مناسبة من 0.025٪ تريبسين لمدة 5 دقائق ، متبوعا ب DMEM بنسبة 10٪ FBS. ماصة 4 مل من خليط الخلية والوسائط في أطباق ثقافة سعة 6 مل.
ملاحظه: توفر لوحة الثقافة سعة 6 مل أكثر من خلايا كافية ، حتى عندما تكون أقل من 50٪ ملتقا.
- قم بتعريض خطوط خلايا HNSCC لظروف مختلفة قبل 24 ساعة من التلوين والطلاء على مقايسة DRG. أعد جرعة الحالة بمجرد طلاء الخلايا للحفاظ على بيئة متسقة.
ملاحظه: أضف الأجسام المضادة أو عوامل النمو أو السيتوكينات أو الجزيئات الأخرى إلى أطباق زراعة الخلايا بعد 1-2 أيام من تشريح الفأر وزرع DRG في المصفوفة.
- أضف بقع الخلايا الفلورية لمدة ساعة واحدة قبل طلاء الخلايا (2-3 أيام بعد حصاد DRG وزرعها في المصفوفة).
ملاحظه: تمر البقع الخاصة المستخدمة هنا بحرية عبر غشاء الخلية. ومع ذلك ، بعد التفاعل مع مجموعات الثيول داخل الخلايا ، تبقى البقعة داخل الخلية وتنتقل إلى الخلايا الوليدة. يسهل التلوين بشكل كبير التصور داخل المقايسات. هذه البقع المؤقتة مثالية لهذه المقايسات لأن التألق موجود لمدة 2-3 أيام ، وهو الإطار الزمني لهذه التجارب. كما أنه يسمح باستخدام العديد من الألوان المختلفة ويغني عن الحاجة إلى إنشاء خطوط خلايا منقولة بالبروتين الفلوري.
- قم بإعداد 10 ميكرومتر من محلول الصبغة عن طريق خلط 2 ميكرولتر من بقع خلايا مخزون 10 ملي في 2 مل من DMEM الخالي من المصل لكل حالة خلوية. قم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الخلايا.
- قم بإزالة وسط المزرعة داخل اللوحة سعة 6 مل ، مع ترك خلايا HNSCC الملتصقة على اللوحة. أضف 2 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وقم بإزالة 2 مل من 10 ميكرومتر من الصبغة الخلية / DMEM الخالي من المصل المضاف إلى كل لوحة.
- أعد لوحة الثقافة سعة 6 مل مع بقعة الخلية إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- بعد 40 دقيقة ، استنشق الوسط. أضف 2 مل من PBS ثم استنشقها. أضف 1 مل من 0.025٪ تريبسين إلى كل طبق واستبدلها في حاضنة 37 درجة مئوية.
- أضف 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS بعد 3-5 دقائق وانقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS.
- عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي ثم أضف DMEM مع FBS بنسبة 10٪ لإنشاء تركيز خلية نهائي يبلغ 300,000 خلية لكل مل.
< p class = "jove_title" >
4. تصفيح خلايا سرطان الرأس والرقبة
- قم بإزالة الألواح ذات القاع الزجاجي باستخدام فحوصات المصفوفة DRG من الحاضنة.
ملاحظه: مرة أخرى ، تكون مناسبة عندما تكون الخلايا العصبية على الأقل 75٪ من الطريق إلى حافة المصفوفة ، والتي تحدث بشكل عام بعد 2-3 أيام. من الأفضل رؤية هذا باستخدام هدف 10X على الأقل.
- استنشق الوسط داخل اللوحة ذات القاع الزجاجي. قم بشفط الوسط بالكامل داخل بئر الزجاج دون إزالة وحدات المصفوفة DRG.
- ارسم 200 ميكرولتر من وسط 300,000 خلية/مل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. ضع قطرتين من الخلايا فوق كل مقايسة مصفوفة DRG. قم بتنفيذ هذه الخطوة لكل قطرة مصفوفة ، وإنشاء أربعة تكرارات لكل حالة خلية على لوحة واحدة.
ملاحظه: يسمح الشكل نصف الكروي للمصفوفة للخلايا بالاستقرار في حلقة على طول محيط الفحص (الشكل 3 أ ، الشكل 3 ب). إن العثور على ماصة ذات زناد سلس يجعل وضع القطرات الموحدة أسهل بكثير.
- تأكيد أرقام الخلايا المتشابهة وتوزيع ظروف الخلية المختلفة تحت الفحص المجهري 4X.
- ضع الألواح ذات القاع الزجاجي في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تقريبا< / >
ملاحظه: على الرغم من وجود حجم صغير فقط من الخلايا والوسائط (~ 150 ميكرولتر) ، إلا أن المقايسات لا تجف حتى انقضاء عدة ساعات من وقت الحاضنة.
- بعد 60 دقيقة ، أضف 4 مل من DMEM برفق مع 10٪ FBS على طول الجدار الجانبي للوحة ذات القاع الزجاجي.
ملاحظه: على مدى فترة من الزمن ، تلتصق الخلايا جزئيا بقاع اللوحة ، ولا تزعج طريقة إضافة الوسيط الخلايا. قد تستغرق أنواع الخلايا المختلفة وقتا أطول أو أقل لبدء الالتصاق بلوحة القاع الزجاجي.
- استبدال أي أدوية خارجية أو عوامل النمو في هذا الوقت للحفاظ على مستويات التركيز السابقة.
- أعد المقايسات إلى الحاضنة 37 درجة مئوية ، إلا عند فحصها مجهريا. حدد نتائج هذا الفحص عن طريق التصوير المجهري. باختصار ، احسب خيوط الغزو حول العصب ضمن أربعة أرباع باستخدام صورة مجهرية 4X.
ملاحظه: المجهر ذو الهدف 4X وقدرات التألق مناسب لتوثيق الفحوصات. يتناسب حجم المقايسات بشكل جيد مع مجال هدف 4X ، وهو مفصل بما يكفي لالتقاط المناطق الفردية للغزو حول العصب. يصبح الغزو حول العصب واضحا في غضون 24 ساعة ، ولكن بعد 48 ساعة ، تبدأ سلامة المقايسات في الضعف ، حيث تنقسم الخلايا السرطانية على طول محيط المصفوفة وتغزوها. بعد 48 ساعة ، هناك أيضا تدفق كبير من الخلايا الليفية من DRG ، مما يحجب التصور باستخدام الفحص المجهري الساطع. لذلك ، ينصح بتوثيق النتائج بالتصوير باستخدام الفحص المجهري 4X مرتين على الأقل خلال هذه النافذة (على سبيل المثال ، في 24 و 48 ساعة بعد طلاء الخلايا السرطانية). ضع في اعتبارك أن هذه فحوصات ثلاثية الأبعاد ، ومن الصعب تصوير الفحص بأكمله بالكامل. يحدث معظم الغزو حول العصب في مستوى من أسفل اللوحة ، حيث يتم تضمين الخلايا في المصفوفة أعلى قليلا من قاع اللوحة. نظرا لأن هذا المستوى قريب من الأفقي ، يتم التقاط الغالبية العظمى من الخلايا العصبية التي تحتوي على خلايا سرطانية في صورة أحادية المستوى عند 4X.
