مقايسة التمييز السكاني الجانبي للسرطان: طريقة لعزل الخلايا الجذعية الشبيهة بالسرطان باستخدام مقايسة Hoechst Dye Flows

الملخص

المصدر: Gilormini ، M. et al. عزل وتوصيف مجموعة فرعية من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة لها خصائص الخلايا الجذعية. J. Vis. Exp. (2016)

في هذا الفيديو ، نصف عزل مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة بالسرطان عن خطوط خلايا سرطان الحرشفية في الرأس والرقبة باستخدام فارز الخلايا المنشط بالفلورة أو FACS. يمكن استخدام المجموعة الجانبية المعزولة للخلايا لمزيد من التحليل النهائي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. اختيار مجموعة جانبية (SP) بواسطة اختبار Hoechst Dye Flow

1. تلطيخ 50 مليون خلية بصبغة Hoechst 33342
   1. قم بإعداد أنبوبين معقمين سعة 15 مل بقاع مخروطي: أنبوب واحد يسمى "Hoechst" ، والآخر يحمل اسم "Hoechst و Verapamil". تحضير 10 مل من محلول هيدروكلوريد فيراباميل 5 ملي مولار في ماء معقم. تحضير وسط الاستزراع (سم) للخلايا الجذعية.
      1. لتحضير CM ل CSC (CM-CSC) ، اجمع بين ما يلي: وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM): F12 (1: 3 ، v: v) ، 5٪ من مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، 0.04 مجم / لتر من الهيدروكورتيزون ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، 0.1 جم / لتر من الستربتومايسين ، و 20 ميكروغرام / لتر من عامل نمو البشرة (EGFR).
   2. تحت غطاء التدفق الصفحي ، قم بعمل التربسين في الخلايا. قم بإزالة الوسائط واغسلها بمحلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) ، وأضف 1 مل من التربسين EDTA (0.5 جم / لتر) لقارورة 75 سم مربع. احتضان 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل عن طريق إضافة وسيط ثقافة يستخدم لخط الخلية الأبوية. احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
      1. لتحضير CM لخط الخلايا الأبوية (CM-P) ، استكمل DMEM بنسبة 10٪ FCS ، و 0.4 مجم / لتر من الهيدروكورتيزون ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 0.1 جم / لتر من الستربتومايسين.
   3. قم بتخفيف معلق الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.1.2 للحصول على 10⁷ خلايا / مل في CM-P. قم بتقسيم تعليق الخلية في الأنبوبين المجهزين: ضع 100 ميكرولتر (10⁶ خلايا) في أنبوب "Hoechst و Verapamil" و 4 مل (4 × 10⁷ خلايا) في الأنبوب "Hoechst".
   4. في عينة "Hoechst and Verapamil" ، أضف 10 ميكرولتر من محلول هيدروكلوريد فيراباميل 5 ملي مولار (التركيز النهائي: 0.5 مليمتر) واخلطه برفق. أضف 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 1 جم / لتر (التركيز النهائي: 0.1 جم / لتر). في عينة "Hoechst" ، أضف 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 1 جم / لتر لكل 10⁶ خلايا (إجمالي 200 ميكرولتر). من الآن فصاعدا ، حافظ على العينات محمية من التعرض المباشر للضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
   5. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة و 30 دقيقة.
   6. أنابيب الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق كل حبيبات ب 2 مل من 1x PBS.
   7. أنابيب الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات "Hoechst and Verapamil" في 500 ميكرولتر من 5 ملغم/لتر يوديد بروبيديوم (PI) المخفف في المخزن المؤقت PBS وحبيبات "Hoechst" في 4 مل من 5 ملغم/لتر PI مخفف في مخزن مؤقت PBS.
   8. انقل محاليل العينات من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الركام وجمع الخلايا المفردة في أنابيب لامتصاص العينة على مقياس التدفق الخلوي. احتفظ بالعينات على الثلج واحمي من التعرض المباشر للضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.

2. عزل السكان الجانبيين باستثناء صبغة Hoechst عن طريق فرز الخلايا

1. قم بإجراء فصل الخلايا السلبية Hoechst على فارز قياس التدفق الخلوي باستخدام المعلمات التالية: ليزر الأشعة فوق البنفسجية (355 نانومتر) ، وكاشفان على مسار ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع مرشحات Hoechst الأزرق (450/50 BP) ومرشحات Hoechst الحمراء (610/20 BP) ، واثنين من المجمعين.
   1. أولا ، قم بتحليل عينة "Hoechst" التي تعمل كعنصر تحكم إيجابي في التلوين وإعداد مقياس التدفق الخلوي.
   2. باستخدام برنامج مقياس الخلوي ، في نافذة "ورقة العمل العالمية" ، انقر فوق "Dot Plot" (الصورة الخامسة العلوية اليمنى) وقم بإنشاء مخطط على ورقة العمل العالمية. في الإحداثيات ، بنقرة بزر الماوس الأيمن ، حدد FSC-A (مبعثر أمامي) وعلى abscissa ، SSC-A (مبعثر جانبي) (الشكل 1 أ). بنفس الطريقة ، قم بإنشاء مخطط نقطي SSC-W مقابل SCC-H. في مخطط النقطة الثاني هذا ، لإنشاء منطقة P1 ، انقر فوق "بوابة المضلع" (الصورة الرابعة عشرة العلوية اليمنى) (الشكل 1 ب).
      ملاحظه: ستشمل منطقة P1 خلايا مفردة وتمييز الزوجي.
   3. اختياري: استبعاد الخلايا الموجبة PI عن طريق إنشاء FSC-A مقابل PI مسور على P1. في هذا المخطط النقطي ، حدد السكان السالب ل PI (P2) لاستبعاد الخلايا الميتة الموجبة PI.
   4. باستخدام برنامج مقياس الخلوي ، في نافذة "ورقة العمل العالمية" ، انقر فوق "Dot Plot" وقم بإنشاء مخطط على ورقة العمل العالمية. عند الإحداثية ، بنقرة بزر الماوس الأيمن ، حدد Hoechst-A الأزرق وعلى abscissa ، أحمر Hoechst-A. بالنقر بزر الماوس الأيمن على السكان، حدد "إظهار السكان" و P1. في هذا المخطط النقطي ، قم بإنشاء منطقة (P2) لتحديد الخلايا السلبية للمجموعة الجانبية لصبغة Hoechst (SP) التي تظهر كذراع جانبي على يسار المجموعة الرئيسية للخلايا (الشكل 1C).
2. قم بتحليل عينة "Hoechst" وجمع 10,000 حدث. للتأكد من أن البوابة P2 ، التي تمثل سكان SP ، في وضع جيد ، قم بتحليل عينة "Hoechst and Verapamil" (10,000 حدث) لمراقبة اختفاء سكان SP (الشكل 1D).
3. اجمع الخلايا السالبة لصبغ SP Hoechst في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1 مل من CM-CSC المحضر في الخطوة 1.1.1.
4. في نهاية فرز الخلية ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات ب 1 مل من CM-CSC. احسب عدد الخلايا التي تم فرزها باستخدام عداد الخلايا وانقل عددا مناسبا من الخلايا إلى قارورة مزرعة (انظر الجدول 1). أضف CM-CSC واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ جو
5. حافظ على الخلايا في الثقافة في نفس الظروف لمدة أقصاها ممرين حتى يكون هناك ما لا يقل عن 5 × 10⁷ خلايا.

الجدول 1: نوع قارورة الثقافة لاستخدامها وفقا لعدد الخلايا التي تم فرزها. يتم إعطاء تفاصيل حجم قارورة الثقافة لعدد تقريبي من الخلايا التي تم فرزها. يتم أيضا توفير حجم التربسين وحجم الوسط المطلوب لنوع قارورة الاستزراع.

عدد الخلايا التي تم فرزها نوع قارورة الثقافة حجم التربسين (مل) حجم متوسط الثقافة (مل) 10,000-200,000 1 بئر من طبق 6 آبار أو طبق بتري 3.5 سم 0.5 2 200,000-1,000,000 1 قارورة ثقافة T25 1 4 >1,000,000 1 قارورة ثقافة T75 2 10

النتائج

الشكل 1: عزل مجموعة سكانية جانبية باستثناء صبغة Hoechst.(أ) مخطط نقطة FSC-A مقابل SSC-A. (ب) SSC-W مقابل SSC-H نقطة. (ج، د) Hoechst Red-A مقابل Hoechst Blue-A مخطط نقطي باستخدام أنبوب "Hoechst" (C) أو مع أنبوب "Hoechst و Verapamil" (D).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل عجل الجنين الذهبي جنرال إلكتريك للرعاية الصحية أ 15-151 الهيدروكورتيزون قابل للذوبان في الماء سيجما ألدريتش H0396-100 ملغ البنسلين / الستربتومايسين 100x دومينيك دوتشر L0022-100 DMEM جيبكو 61965-026 F12 مزيج الجوز (1x) + GlutaMAX-I جيبكو 31765-027 EGF بروميجا جي 5021 يجب تحضير الحل
قبل الاستخدام مباشرة لأنه
غير مستقر الهيبارين تقنيات StemcellTM 7980 ملحق B-27 (50x) ، ناقص
فيتامين أي جيبكو هاتف: 12587-010 البنسلين / الستربتومايسين 100x دومينيك دوتشر L0022-100 DMEM جيبكو 61965-026 ملحق B-27 (50x) ، ناقص
فيتامين أي جيبكو هاتف: 12587-010 هوشت: 33342 سيجما ألدريتش 14533 سمية أكالة وحادة (عن طريق الفم ،
الجلد ، الاستنشاق) الفئة 4 هيدروكلوريد فيراباميل سيجما ألدريتش [ف-4629] السمية الحادة (عن طريق الفم ، الجلد ،
الاستنشاق) الفئة 3 بروبيديوم يوديد سيجما ألدريتش ص 4170 السمية الحادة (عن طريق الفم ، الجلد ،
الاستنشاق) الفئة 4 خط خلية SQ20B هدية من John Little's
مختبر - خط خلية FaDu ATCC إتش تي بي-43 BD FACSبرنامج ديفا v8.0.1 BD Biosciences -