فحص موت الخلايا باستخدام تلطيخ DAPI: طريقة للفحص السريع لموت الخلايا المستنسخة الناجم عن الأشعة تحت الحمراء في خطوط الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Kobayashi ، D. et al. بروتوكول من خطوة واحدة لتقييم طريقة موت الخلايا المستنسخة الناجم عن الإشعاع عن طريق المجهر الفلوري. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو منهجية فحص ملفات تعريف موت الخلايا الرئيسية في خطوط الخلايا السرطانية التي يسببها الإشعاع المؤين (IR) باستخدام مقايسة تلطيخ DAPI. تظهر النوى الملطخة ب DAPI للخلايا المستهدفة التي تخضع لموت الخلايا مورفولوجيا مميزة ويمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. أغطية الأوتوكلاف
   1. ضع أغطية في دورق زجاجي.
   2. غطي الدورق الزجاجي بورق الألمنيوم.
   3. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية عند 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
   4. يجف عند 50 درجة مئوية. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في غطاء للثقافة.
2. تحضير محلول التثبيت: 3٪ بارافورمالدهيد + 2٪ سكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
   1. إلى زجاجة زجاجية سعة 1,000 مل ، أضف 700 مل PBS و 30 جم بارافورمالدهايد.
      أنذر: بارافورمالديهايد تآكل ، ارتد قفازات مناسبة.
   2. قم بإذابة بارافورمالدهيد تماما عن طريق التسخين إلى 80 درجة مئوية باستخدام الميكروويف.
      أنذر: أبخرة بارافورمالدهيد سامة ، ارتد قناعا.
   3. اتركيه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
   4. أضف 20 جم سكروز.
   5. أضف PBS لجعل الحجم الإجمالي 1 لتر.
   6. Aliquot في أنابيب 50 مل. يمكن تخزين محلول التثبيت لمدة 3 سنوات عند -20 درجة مئوية أو لمدة 3 أشهر عند 4 درجات مئوية.

< ص الفئة = "jove_title" >2. التشعيع

تنبيه: تعامل مع جهاز الأشعة السينية بعناية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

1. افحص الخلايا تحت مجهر الطور المقلوب. تأكد من أن الخلايا متصلة بقلة الغطاء وعلى قيد الحياة.
2. قم بإشعاع الطبق ب 6 أشعة سينية Gy (1.4 Gy / دقيقة ، 300 KVP ، 20 مللي أمبير).
3. احتضان لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يمكن تعديل وقت الحضانة وفقا للتصميم التجريبي

< p class = "jove_title" >3. التثبيت

1. استنشق وسائط الثقافة من الطبق.
2. باستخدام المقص ، قم بقص طرف ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر على بعد 5 مم من النهاية.
   ملاحظه: يساعد الطرف المقطوع على تطبيق محلول التثبيت بسلاسة.
3. باستخدام الطرف المقطوع ، أضف 1 مل من محلول التثبيت (المحضر في الخطوة 1.2) إلى الطبق من الجدار الجانبي للطبق.
   ملاحظه: هذه الخطوة حساسة للوقت وبالتالي يجب إجراؤها دون تغيير أطراف الماصات الدقيقة عند التعامل مع عينات متعددة. يمكن أن يؤدي تطبيق محلول التثبيت مباشرة في قاع الطبق إلى إتلاف الخلايا.
4. ضع الطبق في طبق ثقافة مربع. رج طبق الثقافة المربع برفق لتوزيع محلول التثبيت على الغطاء بالتساوي.
5. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. محلول تثبيت الشفط من الطبق.
7. أضف 2 مل من PBS إلى الطبق من الجدار الجانبي للطبق.
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي تطبيق PBS مباشرة في قاع الطبق إلى إتلاف الخلايا.
8. استنشق PBS من الطبق.
9. كرر الخطوتين 3.7 و 3.8 مرتين.
   ملاحظه: يمكن تخزين الطبق لمدة أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية مع غمر الأغطية في 2 مل PBS.

فئة

4. تلطيخ DAPI

1. على شريحة زجاجية ، ضع كاشف تلطيخ DAPI 5 ميكرولتر 1 ميكروغرام / مل.
   ملاحظه: يكون كاشف تلطيخ DAPI مستقرا لمدة 6 أشهر عند تخزينه محميا من الضوء عند أو أقل من -20 درجة مئوية.
2. باستخدام مشرط ، قم بإزالة الغطاء من الطبق.
3. اسحب PBS الزائد على الغطاء عن طريق لمس حافة الغطاء بمنشفة ورقية.
4. قم بتركيب الغطاء رأسا على عقب على قطرة كاشف تلطيخ DAPI على الشريحة الزجاجية بحيث تتعرض الخلايا لكاشف تلطيخ DAPI.
   ملاحظه: هذه الخطوة حساسة للوقت. يمكن أن يؤدي تجفيف كاشف تلطيخ DAPI إلى تلطيخ دون المستوى الأمثل.
5. يمكن تخزين العينات لمدة عام واحد عند -20 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات زلة الغطاء ماتسونامي C013001 بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش P6148-1 كجم سكروز سيجما ألدريتش 84097-250 جرام محلول ملحي مخزن بالفوسفات كوزمو بيو هاتف: 16232000 مشرط كاي الطبية رقم 20 ، 520 أ طبق زراعة الخلايا 35 مم صقر 353001 مجهر الطور المقلوب شيمازو 114-909 مشع بالأشعة السينية الفاكسيترون بيوبتيكس فاكسيترون RX-650 طبق ثقافة مربع كورنينج هاتف: 431110 زجاج منزلق ماتسونامي برو -11 كاشف تلطيخ DAPI إشارات الخلية 8961 ثانية المجهر الفلوري نيكون كسوف نيني مرشح DAPI المجهر الفلوري نيكون U-FUW ، BP340-390 ، BA420IF ، DM410 عدسة مجهر مضان (20×) نيكون خطة Apo λ 20X / 0.75 عدسة مجهر مضان (60× ، زيت) نيكون خطة Apo λ 60X / 1.40 زيت نفط أوليمبوس N5218600 كاميرا CCD نيكون DS-Qi2 برنامج الحصول على الصور الرقمية نيكون وثيقة عناصر NIS منظف العدسة أوليمبوس OT0552 كلوروفورم واكو 035-02616