تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير سقالة المريء منزوعة الخلايا
- احصل على مريء الخنازير السليمة في مسلخ من خنازير Landrace المذبوحة حديثا والتي تستخدم لإنتاج الغذاء. سيوفر مريء واحد سقالات كافية لما يقرب من 30 بنية منفصلة.
ملاحظه: نظرا لبروتوكول التعقيم الشامل والمستهلك للوقت المطلوب ، فإن الأمر يستحق عادة الحصول على ما لا يقل عن 10 مريء ومعالجته في وقت واحد.
- ضع المريء المستأصل حديثا على الفور في وعاء معقم سعة 180 مل يحتوي على حوالي 150 مل من محلول بوفيدون اليود بنسبة 10٪ لمدة 5 دقائق لتقليل أي حمل ميكروبي ملوث. انقل المريء إلى وعاء ثان يحتوي على حوالي 100 مل من PBS المعقم الذي يحتوي على 200 وحدة دولية / مل من البنسلين ، و 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 1.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B.
- استبدل غطاء الحاوية وانقل المريء مرة أخرى إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة. يمكن نقل مريئتين أو ثلاث مريء في كل حاوية ، اعتمادا على حجمها.
- بمجرد وصولك إلى المختبر ، تعامل مع الأنسجة في غطاء التدفق الصفحي باستخدام تقنية معقمة لتقليل التلوث الميكروبي. قم بتعقيم الملقط والمقص وشفرات المشرط عن طريق النقع لمدة 5 دقائق في 70٪ من الإيثانول والشطف في PBS معقم.
- تعامل مع المريء باستخدام ملاقط معقمة. باستخدام المقص ، افتح المريء طوليا. اشطف المنديل عن طريق وضع المريء في وعاء معقم سعة 180 مل يحتوي على ما يقرب من 100 مل من PBS المعقم ورجها برفق لإزالة أي حطام.
- نظف لوح تشريح الفلين عن طريق الرش بكمية وفيرة من الإيثانول بنسبة 70٪ واتركه حتى يجف.
- قم بإزالة المريء من PBS ، وباستخدام إبر معقمة ، قم بتثبيت المريء على السبورة ، والسطح المخاطي العلوي. أمسك السطح المخاطي في أحد طرفي المريء بملاقط معقمة وابتعد عن اللوحة. سيؤدي ذلك إلى فصل الغشاء المخاطي عن تحت الغشاء المخاطي الأساسي.
- بعد ذلك ، استخدم شفرة مشرط معقمة لتشريح المريء طوليا على طول الصفيحة الخاصة ، وإزالة المسامير مع تقدم التشريح للسماح برفع الغشاء المخاطي بعيدا.
- احتفظ بالغشاء المخاطي المقطوع وتخلص من تحت الغشاء المخاطي الأساسي.
- قم بقطع والتخلص من 2 سم القريبة والبعيدة من الغشاء المخاطي حيث يوجد عدد أكبر من الغدد تحت المخاطية وصفيحة خاصة أكثر سمكا في تلك المناطق ، على التوالي.
- استخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة المتبقية إلى 5 سم2. ضع كل الأنسجة المقطوعة في وعاء معقم سعة 180 مل يحتوي على حوالي 150 مل من PBS المعقم وحركه برفق لشطف الأنسجة. في حالة معالجة أكثر من خمسة مريء في وقت واحد ، فقد يكون من الضروري استخدام أواني متعددة لهذا والخطوات الثلاث اللاحقة.
- باستخدام ملاقط معقمة ، انقل الأنسجة المقطوعة إلى وعاء سعة 180 مل يحتوي على 150 مل من 1 M كلوريد الصوديوم المعقم ، و 200 وحدة دولية / مل من البنسلين ، و 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 1.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B. احتضان لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- ضع المنديل في وعاء جديد سعة 180 مل يحتوي على 150 مل من PBS المعقم. ستبدأ الظهارة في الانفصال بشكل واضح عن الأنسجة الأساسية. قشر الظهارة المنفصلة برفق عن مريء الخنزير باستخدام ملقط معقم وتخلص منه.
- ضع الأنسجة المتبقية في قدر جديد سعة 180 مل وأضف 150 مل من PBS المعقم. حرك برفق لمدة 5 دقائق لغسله. اسكب PBS وكرر مرتين أخريين باستخدام PBS الطازج.
- ضع كل الأنسجة في زجاجة زجاجية سعة 500 مل تحتوي على 400 مل من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 80٪ (حجم / حجم) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى 400 مل من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 90٪ (حجم / حجم) لمدة 24 ساعة أخرى.
- يحفظ في 400 مل من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أشهر على الأقل لتجفيف الأنسجة وتعقيمها مع الحفاظ على سلامة الغشاء القاعدي.
