استخراج الإكسوسوم القائم على الخرز المغناطيسي: تقنية لعزل إكسوسومات معينة من السوائل الحيوية

الملخص

المصدر: Tu, M. et al. الكشف عن المؤشرات الحيوية الخارجية عن طريق الإطلاق والقياس الناجم عن المجال الكهربائي (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء لعزل الإكسوسومات من السوائل الحيوية المستهدفة باستخدام الميكروبيدات المغناطيسية. يتيح الإجراء التقاط سريع للإكسوسومات ، والتي يمكن استخدامها لتحليل المصب.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. استخراج الإكسوسوم القائم على الخرزة المغناطيسية

1. الماصة محلول مختلط جيدا من 5 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين في 495 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في أنبوب طرد مركزي دقيق لإعادة تعليق الخرز. اغسل الخرزات وأعد تعليقها ب 500 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات باستخدام رف مغناطيسي. الرف عبارة عن مجموعة من المغناطيس على جانب وحدة الإسكان التي يمكنها حمل عينة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
   1. لكل غسلة ، أولا ، اترك الأنابيب تجلس على الرف لمدة 1 دقيقة ثم استخدم طرف الماصة لإزالة المخزن المؤقت الطافي بعناية دون إزعاج الخرز.
   2. ضع الأنابيب على رف عادي بدون مغناطيس على الجانب. أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى الأنابيب واستخدم الماصة لخلط المحلول والخرز معا. بعد ذلك ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لفصل الخرزات عن المحلول مرة أخرى.
   3. قم بإجراء هذه الإزالة للمخزن المؤقت عن طريق المغنطة وإعادة التعليق في PBS ما مجموعه ثلاث مرات. هذا يؤدي إلى غسل أولي للجزيئات المغناطيسية.
2. أعد تعليق الخرزات إلى 490 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS ، مع وضع الأنبوب على الجزء غير الممغنط من الرف المغناطيسي. ماصة 5 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المضاد للإنسان CD63 بتركيز 1.0 مجم / مل في خليط الخرز. استخدم الماصة لخلط الخرزات والأجسام المضادة في المحلول.
3. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع خليط من الخرزة والأجسام المضادة البيوتينيل على دوار العينة. اضبط معلمات الدوار لمحور دوار العينة للدوران المتبادل عند إمالة 90 درجة لمدة 5 ثوان والاهتزاز عند 5 درجات لمدة 1 ثانية. قم بتدوير أنابيب خليط العينة عند هذه المعلمات لمدة 30 دقيقة في RT.
4. إزالة الجسم المضاد غير المرتبط بعد الاقتران.
   1. بعد 30 دقيقة من الدوران في RT ، ضع الأنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
   2. قم بإجراء ثلاث غسلات من الخرز عن طريق إزالة المرحلة السائلة باستخدام ماصة دقيقة وغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS. بعد الغسيل الثلاثي ، أعد تعليق الخرزات في 490 ميكرولتر من الكازين-PBS وضعها على الجزء غير الممغنط من الرف.
5. استخراج الإكسوسوم باستخدام حبات مغلفة بالأجسام المضادة.
   1. قم بتسمية كل أنبوب بمعرف العينة المستهدفة. ماصة عينة 10 ميكرولتر من المصل أو اللعاب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. استخدم الماصة لخلط العينة والخرز المغناطيسي عن طريق سحب العينة عدة مرات.
   2. ضع الأنابيب مع عينة وخرز الأجسام المضادة CD63 المضادة للإنسان على الدوار وقم بتدويرها لمدة ساعتين عند RT. استخدم نفس معلمات المدورة كما هو موضح في الخطوة 1.3.
   3. بعد ساعتين من دوران العينة ، قم بإجراء غسيل ثلاثي عن طريق المغنطة لفصل الخرز عن المحلول ، وإزالة الطور السائل باستخدام ماصة دقيقة ، وتعليق الخرز في 500 ميكرولتر من محلول Tris-HCl. ترتبط الخرزات الناتجة الآن بالإكسوسومات وهي جاهزة لإطلاق المجال الكهربائي وقياسه.

المواد