$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. هضم الأنسجة
- باستخدام صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 100 مم ، قم بفرم الأنسجة ميكانيكيا إلى قطع دقيقة ~ 1-2 مم في الحجم باستخدام مقص تشريح معقم بالأوتوكلاف وملقط جراحي (الشكل 1 ب ، ج). يجب قطع النسيج الضام بين القطع لضمان الفصل المناسب والسهولة في خطوات أخرى.
- أضف 6 مل من محلول التباين / الكولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة تقريبا.
- قم بتعطيل الأنسجة عن طريق سحب العينات باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل 15-20 مرة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إلى 1 ساعة.
- كرر الخطوتين 1.3 و 1.4 مرتين أو ثلاث مرات أخرى أو حتى يشبه النسيج الملاط ويمكن أن يمر بسهولة عبر فتحة الماصة (الشكل 1D).
ملاحظه: سيحدد الحجم الأولي لعينة الأنسجة وكيف ستحدد دقة فرم الأنسجة عدد المرات التي يحتاج فيها المرء إلى تكرار الخطوتين 1.3 و 1.4. عادة ، نتلقى أنسجة بحجم 1 سم × 1 سم تقريبا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء مراقبة تفكك الأنسجة باستخدام مجهر قياسي لزراعة الأنسجة المقلوبة لتتبع تقدم تفكك الخلايا عن الأنسجة. تعتبر المجموعات الصغيرة من الخلايا مثالية للنمو الأولي للخلايا اللعابية كحلبة.
< p class = "jove_title" >
2. طلاء الآبار بمصفوفة غشاء القاعدة
ملاحظة: يجب إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) طوال الليل عند 4 درجات مئوية في اليوم السابق لاستخدامها. بمجرد إذابته ، يجب الحفاظ على BMM باستمرار على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لأنه سوف يتجمد بسرعة (أي يشكل هلام) في درجات حرارة أكثر دفئا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر إذا تم تبريد العينات على الجليد قبل الطلاء على BMM لأن العينات الباردة سوف "تذوب" BMM وتعرض الخلايا للطبق البلاستيكي.
- قم بوضع الماصة ببطء BMM (انظر جدول المواد) في كل بئر ليتم تغطيتها. قم بتوزيع BMM بالتساوي وببطء على البئر.
ملاحظة: بشكل عام ، نستخدم 500 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار ، ولكن يمكن تعديل هذا الحجم للاستخدام في أنواع أخرى من الألواح ، مثل 12 بئرا أو 24 بئرا ، أو حسب الرغبة للهلاميات المائية السميكة أو الرقيقة.
- احتضان الألواح المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام للسماح بوقت BMM للتصلب.
< p class = "jove_title" >
3. تصفية الأنسجة غير المهضومة ، تحلل كرات الدم الحمراء ، وطلاء الخلايا
- نقل الأنسجة متجانسة من الخطوة 1.5 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. اغسل الطبق مرة واحدة ب 6 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco لنقل الخلايا المتبقية.
- قم بتصفية المتجانس في أنبوب مخروطي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون 70 ميكرومتر لإزالة الأنسجة غير المهضومة. خلايا متوترة بأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
- قم بتخفيف 10x RBC Lysis Buffer في dH2O معقم لعمل حل عمل 1x.
- شفط المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من 1x مخزن تحلل كرات الدم الحمراء. احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- أضف 20-25 مل من DPBS لتحييد المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء وتقليل تحلل الخلايا اللعابية. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × <br / >
ملاحظه: بعد العلاج باستخدام محلول تحلل كرات الدم الحمراء ، يجب أن تكون حبيبات الخلية بيضاء. يشير اللون الأحمر في الحبيبات إلى أنه لم يتم تحلل جميع كرات الدم الحمراء بالكامل. كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.5 إذا لزم الأمر للتحلل الكامل لجميع كرات الدم الحمراء.
- شفط المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 1-2 مل من BEGM لكل بئر ، ثم ضع الخلايا المعلقة على الآبار المطلية ب BMM. احتضان عند 37 درجة مئوية.
- بمجرد طلاءها على BMM ، ستتشكل الخلايا في هياكل كروية أو "صلابية" على مدى 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا على شكل كرات حلبية لمدة 5-7 أيام قبل أن يبدأ BMM في التحلل ، مما يسمح للخلايا بالوصول إلى البلاستيك والالتصاق به والنمو كطبقة أحادية.