القياس الكمي القائم على الجسيمات النانوية المترافقة بالأجسام المضادة باستخدام المجهر المجهري للمجال المظلم: إجراء لالتقاط وقياس جسيمات خارجية معينة من سوائل الجسم

Abstract

المصدر: Wan، M. et al. باستخدام التشتت المعزز بالنانوبلازما والتصوير المجهري منخفض التكبير لتحديد كمية الإكسوسومات المشتقة من الورم. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري منخفض التكبير والمجال المظلم لتحديد كمية الإكسوسومات المحددة في عينات الموائع الحيوية ذات الحجم الصغير. يمكن أن تكون الإكسوسومات التي تم تحديدها على هذا النحو بمثابة مؤشرات حيوية محتملة للسرطان.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحضير مجسات الجسيمات النانوية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يستخدم هذا الاختبار قضبان نانوية ذهبية وظيفية (AuNRs ؛ قطر 25 نانومتر × طول 71 نانومتر) مترافقة تساهميا مع بوليمرات النيوترافيدين (AV) ولها ذروة رنين البلازمون السطحية التي تنتج إشارة تشتت حمراء (ذروة 641 نانومتر) عند إضاءة سوق دبي المالي.

1. اغسل 40 ميكرولتر من AuNR-AV (2.56 × 10¹¹ جسيما) ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر PBS (درجة الحموضة 7.0) عن طريق الطرد المركزي والشفط (8,500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق) ، متبوعة بخطوة طرد مركزي وشفط نهائية يتم بعدها تعليق حبيبات AuNR-AV في 40 ميكرولتر PBS.
2. امزج معلق AuNR-AV هذا مع 10 ميكرولتر من الجسم المضاد البيوتينيل (0.5 مجم / مل) خاص بمستضد على سطح النوع الفرعي للإكسوسوم ذي الأهمية و 150 ميكرولتر من PBS ثم امزجه عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين باستخدام خلاط للسماح لارتباط النيوترافيدين والبيوتين بالوصول إلى الاكتمال.
3. اغسل AuNRs المترافقة بالأجسام المضادة الناتجة (AuNR-IgG) ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي والشفط (6,500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق) ثم علقها في 200 ميكرولتر PBS وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظه: يجب استخدام تقنية معقمة وأوقات تخزين قصيرة لتجنب تلوث وتدهور AuNR-IgG. من الأفضل استخدام AuNRs المترافقة بالأجسام المضادة في غضون 24 ساعة من اقترانها.

2. إعداد شرائح التقاط EV

1. قم بتخفيف الأجسام المضادة المختارة لالتقاط الإكسوسوم إلى 0.025 مجم / مل في PBS وأضف 1 ميكرولتر / بئر من هذا التخفيف على شريحة بروتين A / G متعددة الآبار ثم احتضان هذه الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة للسماح بالتقاط الجسم المضاد المرتبط بالبروتين A / G الثابت على الشريحة.
2. استنشاق الآبار لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وغسلها ثلاث مرات عن طريق إضافة وشفط 1 ميكرولتر / بئر من PBS. بعد ذلك ، قم بتحميل كل بئر ب 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (انظر جدول المواد) واحتضان الشريحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة لمنع أي مواقع ربط بروتين متبقية.
3. شفط الآبار لإزالة المخزن المؤقت المانع ، وغسل الآبار ثلاث مرات عن طريق إضافة وشفط 1 ميكرولتر / بئر من PBS ، واستخدام الشرائح المسدودة على الفور لالتقاط الإكسوسوم وتحليله.

< p class = "jove_title" >3. إعداد المنحنى القياسي

1. لتحديد الوفرة المطلقة أو النسبية لنوع فرعي معين من الإكسوسوم بدقة ، يجب على المستخدم إنشاء منحنى قياسي مع مجموعة إكسوسوم نقية تعبر بشكل موحد عن المؤشر الحيوي لسطح الإكسوسوم ذي الأهمية. تحلل هذه الدراسة وفرة الإكسوسومات التي تعبر عن بروتين غشائي مرتبط بالورم الخبيث ، مستقبل إيفرين A2 ، والذي له علاقة تم الإبلاغ عنها بمرحلة سرطان البنكرياس والتشخيص><. ملاحظه: من المعروف أن خط خلية سرطان البنكرياس البشري PANC-1 والإكسوسومات الخاصة به تعبر عن هذا البروتين وتم استخدام الإكسوسومات المعزولة من هذا الخط الخلوي لتوليد منحنى قياسي لتحديد عدد الإكسوسومات التي تعبر عن هذا البروتين في عينات الإكسوسوم المعقدة.
2. خلايا الزراعة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في وسط مزرعة خالية من المصل للسماح بتراكم الإكسوسوم في الوسائط ، ثم عزل المواد الطافية لزراعة الخلايا عن طريق الطرد المركزي للمزارع المعلقة أو الشفط المباشر لوسط المزرعة من مزارع الخلايا الملتصقة.
قم
3. بالطرد المركزي للوسائط المجمعة عند 2000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة الحطام واستعادة المادة الطافية.
4. قم بتصفية المادة الطافية الموضحة من خلال وحدة مرشح ربط منخفضة البروتين 0.45 ميكرومتر ذات سعة مناسبة (على سبيل المثال ، وحدة ترشيح فراغ بولي إيثر سلفون سعة 250 مل).
5. قم بتركيز المرشح الناتج عن طريق الطرد المركزي عند 3200 × جم باستخدام نظام مرشح حد الوزن الجزيئي الاسمي 100,000 إلى حجم نهائي 250 ميكرولتر. اجمع الحجم المحتفظ به من هذا المرشح ، ثم اغسل الفلتر ب 200 ميكرولتر PBS ، وادمج حجم الغسيل هذا مع حجم عينة الإكسوسوم الذي تم جمعه.
6. قم بالطرد المركزي هذه العينة عند 21,000 × جم لمدة 45 دقيقة واسترجع المادة الطافية بعناية ، مع الحرص على عدم جمع أي مواد مترسبة.
7. جهاز طرد مركزي المادة الطافية المستردة عند 100,000 × جم لمدة 3 ساعات لترسيب الإكسوسومات. استنشق المادة الطافية وجمع حبيبات الإكسوسوم في 100 ميكرولتر PBS.
8. قم بتخزين معلقات الإكسوسوم الناتجة عند 4 درجات مئوية إذا تم استخدامها في غضون 24 ساعة أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
   ملاحظة: لا تعرض عينات الإكسوسوم لتكرار دورات التجميد والذوبان.
9. تحديد كمية من معلق الإكسوسوم بعد الخلط عن طريق القياس المباشر لأعداد الإكسوسوم (على سبيل المثال ، عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية أو استشعار النبض المقاوم القابل للضبط أو عن طريق قياس تركيز البروتين في محللات الإكسوسوم عن طريق مقايسة حمض البيسينكونينيك الميكروي ، أو طريقة مكافئة ، كوسيلة لتقريب كمية الإكسوسوم).
10. قم بإنشاء مجموعة من التخفيفات التسلسلية لتعليق الإكسوسوم للسماح بمقارنة إشارة الجسيمات النانوية بعدد الإكسوسوم المدخل أو محتوى البروتين.
11. انقل 1 ميكرولتر من كل معيار إكسوسوم إلى كل من آباره المكررة على لوحة الفحص.
    ملاحظة: يمكن استخدام المنحنيات القياسية لحساب ميل خط الارتباط بين إشارة الجسيمات النانوية وتركيز الإكسوسوم (1) تقييم أداء الفحص و (2) تحديد التركيز النسبي للإكسوسومات المستهدفة في العينات التجريبية.

< p class = "jove_title" >4. معالجة عينات البلازما البشرية أو المصل

1. جمع عينات البلازما أو المصل بالطرق القياسية وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة لتحليل الإكسوزوم. قم بإذابة العينات بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة. امزج العينات المذابة بشكل متكرر عن طريق الانعكاس لتعزيز التعليق المتجانس.
   ملاحظة: قد لا تكون نتائج عينات المصل والبلازما متكافئة نظرا لوجود إطلاق كبير للإكسوسومات أثناء تفاعل التخثر.
عينات
2. البلازما أو المصل بأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة لترسيب مجاميع البروتين وغيرها من الحطام. انقل كمية من عينة البلازما أو المصل إلى أنبوب جديد وأضف PBS لتوليد تخفيف 1: 1. امزج العينة المخففة عن طريق دوامة لطيفة أو انعكاس، حسب الاقتضاء. انقل 1 ميكرولتر من كل معلق بلازما أو مصل إلى كل من الآبار المكررة على لوحة الفحص.

5. التقاط Exosome واكتشافه

1. قم بتحميل آبار شريحة التقاط EV مسدودة مع 1 ميكرولتر / بئر من عينة الإكسوسوم ، باستخدام 8 مكررات لكل عينة ، واحتضان الشريحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مرطبة. قم بشفط جميع عينات الآبار ثم أضف 1 ميكرولتر / بئر من PBS لغسل الآبار وإزالة الإكسوسومات غير المرتبطة والملوثات الأخرى من عينة الإكسوسوم المحملة.
2. قم بتحميل عينات الآبار بسعة 1 ميكرولتر / بئر من معلق AuNR-IgG المعد مسبقا (انظر القسم 1 أعلاه) واحتضان الشريحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة. قم بشفط محلول الجسيمات النانوية وغسل الشريحة في PBS المكملة بنسبة 0.01٪ Tween-20 (PBST) لمدة 10 دقائق باستخدام الخلاط ، ثم استنشق وغسل جميع الآبار النموذجية بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق باستخدام خلاط دوار وجففها بالهواء لصور LMDFM اللاحقة.
   ملاحظة: يتم تقييم معاملات التباين بين المقايسة (CVs) من ثمانية مكررات من نفس العينة. تعتبر العينات التي تظهر >20٪ من السير الذاتية غير إعلامية ويجب تكرارها إذا كانت هناك عينة كافية.

Materials