تقسيم الاهتزاز لكلية الفئران الكاملة: تقنية لتوليد أقسام رقيقة من كلية الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Grainger ، N. et al. عزل وتصوير مناطق جهاز تنظيم ضربات القلب الحية السليمة في الحوض الكلوي للفأر عن طريق تقسيم الاهتزاز. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح تقسيم الاهتزاز لكلية فأر كاملة للحصول على شرائح رفيعة. يمكن تخزين أقسام الأنسجة المقطعة هذه في درجات حرارة منخفضة حتى مزيد من التحليل النهائي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد الحلول

1. تحضير 1 لتر من محلول بيكربونات كريبس رينجر (KRB) يحتوي على 120.35 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5.9 ملي كلوريد الصوديوم ، و 15.5 ملي مولار من NaHCO₃ ، و 1.2 ملي هيدروجين_{الصوديوم 2}،_و 4،1.2 ملي مولار ، و 2 ملي كلوريد المغنيد₂ ، و 11.5 ملي مولار من الجلوكوز ، و 2.5 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2}. في يوم الاستخدام ، حافظ على محلول KRB على الثلج.
   ملاحظه: يمكن تخزين KRB في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد ويجب أن يتم غليه مسبقا بمزيج من 97٪ O₂ و 3٪ CO₂ لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الاستخدام.

2. تقطيع الاهتزاز للكلى

1. استخدم ملقطا غير حاد للإمساك بالكلية المحضرة وإزالتها برفق من محلول KRB المثلج. ضع الكلى على الفور على ورق ماص لمدة ~ 2-4 ثوان لإزالة الرطوبة الخارجية الزائدة. قم بلف الكلية برفق عبر الورق الماص للتأكد من جفاف جميع جوانب الحمة بحيث يكون هناك التصاق مثالي للكلية بمرحلة الاهتزاز.
   ملاحظة: نظرا لأن الحوض الكلوي يقع داخل الكلى وبالتالي فهو محمي بواسطة الحمة الخارجية ، فإن فترة التجفيف القصيرة هذه لن تضر بسلامة الأنسجة.
2. ضع على الفور طبقة رقيقة من غراء cyanoacrylate (~ 1 سم²) على قاعدة لوحة عينة الاهتزاز واستخدم ملقطا غير حادة لوضع الكلى ، جانب الحالب لأسفل ، على المنطقة المغطاة بالغراء. ضع ضغطا لأسفل برفق على الجزء العلوي من الكلى باستخدام الحافة المسطحة للملقط لمدة 10-20 ثانية تقريبا لتجفيف الغراء.
   ملاحظه: لتثبيت الكلى أثناء هذا الإجراء، استخدم زوجا إضافيا من الملقط للحفاظ على الكلى في وضع مستقيم أثناء جفاف الغراء. من الأهمية بمكان أن تلتصق الكلية بلوحة العينة في وضع رأسي بحيث يتم قطع الأقسام بشكل مستقيم. للتأكد من أن الكلية قد تلتصقت بنجاح بلوحة العينة ، ادفع جانب الكلية برفق. إذا نجحت الكلية في التصاق باللوحة ، فيجب أن تظل قاعدة الكلية مثبتة على اللوحة.
3. قم بتثبيت لوحة العينة بإحكام في أسفل الدرج المؤقت. اضبط مستوى محلول KRB بحيث يتم غمر الجزء العلوي من الكلية بالكامل. أثناء خطوات التقسيم ، عندما تتحرك شفرة الاهتزاز بشكل أعمق في الدرج المؤقت ، قم بإزالة محلول KRB حتى لا ينغمس حامل الشفرة في المحلول.
   ملاحظه: إذا لم يجف الغراء تماما قبل متابعة هذه الخطوة ، فغالبا ما يتحرك الغراء من القاعدة إلى حمة الكلى. هذا الغراء الزائد سيجعل التقسيم أكثر تنوعا. إذا حدث هذا ، فقم بإزالة الكلية من الطبق واستمر في تحضير الكلى الطازجة.
4. لتقسيم الاهتزاز التلقائي ، حدد موضعي البداية والنهاية لدورة قطع شفرة الاهتزاز. تحقق من أن هذه المواضع خالية من الكلى ~ 0.5-1 سم للتأكد من أنه مع كل تقدم للشفرة ، يتم تقسيم مستوى الكلى بالكامل.
5. قم بإعداد صفيحة متعددة الآبار (24 أو 48 بئر) عن طريق ملء الآبار بمحلول KRB ، وضع اللوحة على الثلج.
   ملاحظه: عند الإنشاء ، يجب وضع الأقسام الفردية في آبار منفصلة لتتبع عمق القسم.
6. ابدأ عملية القطع التلقائية. أثناء التمرير الأولي للشفرة ، تأكد من أن الشفرة تتلامس مع الجزء العلوي من الكلى. إذا لم يتم إجراء اتصال ، فاضبط موضع بدء التشغيل Z للشفرة.
7. باستخدام الملقط ، اجمع الأقسام التي يتم تحريرها من الكلى. انقل الأقسام على الفور إلى الآبار الفردية ولاحظ العمق Z للأقسام لقياس موقع PKJ التقريبي داخل أقسام الكلى.
   ملاحظه: اعتمادا على معلمات القطع ، قد لا يتم قطع بعض الأقسام من كتلة الكلى. إذا حدث هذا ، استخدم مقصا زنبركيا ناعما بعناية لقطع أقسام من كتلة الكلى. يتم تشجيع المستخدمين أيضا على تصور الأقسام بنشاط تحت المجهر الضوئي أثناء الطفو بحرية في الآبار الفردية لضمان إعدادات القطع المثلى وموقع الأنسجة. عادة ما يتم اشتقاق الأقسام التي تحتوي على PKJ ~ 1000-1500 ميكرومتر من أعلى الكلى.
8. استمر في بروتوكول التقسيم حتى تصبح مناطق PKJ أكثر وضوحا. ارجع إلى قسم النتائج التمثيلية للحصول على وصف لمناطق PKJ مع استمرار التقسيم.
9. في هذه المرحلة ، قم بتحسين معلمات التقسيم لضمان تحرير الأقسام من كتلة الكلى بشكل موحد وسليمة. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن مناطق PKJ مستمرة وغير مكسورة لأن جدران PKJ المكسورة لن تسمح بالتصوير الكافي للخلايا داخل الجدار بسبب الانهيار. إذا تعرضت الجدران للكسر ، قلل من سرعة التقسيم وقم بزيادة سمك القسم واستمر في مراقبة الأقسام تحت المجهر الضوئي لضبط معلمات القطع.
10. قم بتخزين الأقسام عند 4 درجات مئوية في محلول KRB حتى تبدأ التجريب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 بئر لوحة ثقافة ثيرموفيشر العلمي 142485 لتخزين شرائح الكلى 48 بئر لوحة ثقافة ثيرموفيشر العلمي هاتف: 152640 لتخزين شرائح الكلى ورق ماص فيشر ساينتيك 06-666 أ لتجفيف الكلى قبل وضع الغراء الغراء سيانواكريليت الامازون B001PILFVY للصق الكلى بلوحة العينة ب 6 ؛ 129S-GT (ROSA) 26SoR / J مختبر جاكسون 13148 فئران GCaMP3 ب 6 ؛ 129S-GT (ROSA) 26SoR / J مختبر جاكسون هاتف: 24105 فئران GCaMP6f ب 6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J مختبر جاكسون 19079 الفئران smMHC-CRE C57BL / 6-Tg (Pdgfra-cre) 1Clc / J مختبر جاكسون 13148 الفئران PDGFRa-CRE ملقط رفيع الأطراف أدوات العلوم الدقيقة 11254-20 يستخدم للتشريح الدقيق للكلى شفرات جيليت باللون الأزرق الفضي مزدوجة الحواف الامازون B009XHQGYO للإدخال في حامل شفرة الاهتزاز ملقط الطالب Adson أدوات العلوم الدقيقة 91106-12 لإمساك الكلى وتحريكها بلطف الطالب دومون ملقط أدوات العلوم الدقيقة 91150-20 تستخدم لتشريح الملقط الداخلي اهتزاز لايكا 14048142075 مكون اختياري لمعايرة حركة الشفرة أثناء القطع VT1200 S تهتز شفرة ميكروتوم لايكا 14912000001 يتم إستخدام التكوين 1 في البروتوكول الخاص بنا