النموذج العضوي لورم المثانة: طريقة لزرع عضيات المثانة في مثانة الفئران المتلقية

الملخص

المصدر: Kim, Y. et al. ثقافة ومعالجة وزرع تقويم العظام لعضويات ورم المثانة في الفأر.J. Vis. Exp.(2020)

في هذا الفيديو ، نصف عملية زرع تقويم العضيات لورم المثانة المزروعة في مثانة الفئران لدراسة دور بيئة الأعضاء في تطوير الأورام.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. العضيات الورمية في المثانة < br / >  

ملاحظة: يوصى بمرور عضيات ورم المثانة عندما يصل قطرها إلى 100-150 ميكرومتر.

1. أضف 500 ميكرولتر من الكولاجيناز / التباين إلى الوسط العضوي في صفيحة مكونة من 24 بئرا مع عضيات الورم. الماصة صعودا وهبوطا في مصفوفة الغشاء القاعدي والوسط. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية وحصد الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
   ملاحظه: افحص العضيات المعزولة من مصفوفة الغشاء القاعدي تحت المجهر. إذا لم يتم فصل العضيات عن مصفوفة الغشاء القاعدي ، فقم بزيادة وقت الحضانة أو الماصة عدة مرات.
2. أضف 5 مل من DMEM الدافئ مسبقا ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وشفط المادة الطافية.
3. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA الدافئ مسبقا و 10 ميكرومتر Y-27632. احتضن لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بماصة الخلايا بقوة لأعلى ولأسفل وتحييد التربسين باستخدام 5 مل من DMEM مع 10٪ FBS.
قم
4. بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية.
5. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من الوسط العضوي الدافئ مسبقا واحسب عدد الخلايا السرطانية المفردة.

< p class = "jove_title" >2. زرع تقويم العضيات في المثانة (الشكل 1 أ)

1. تحضير عضيات ورم المثانة لزراعة تقويم العظام
   1. قبل الزرع ، قم بزراعة عضيات ورم المثانة لمدة 5-7 أيام ، كما هو موضح أعلاه.
   2. أضف 500 ميكرولتر من الكولاجيناز / التباين إلى الوسط العضوي في صفيحة مكونة من 24 بئرا مع عضيات الورم. الماصة صعودا وهبوطا في مصفوفة الغشاء القاعدي والمتوسطة. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
   3. أضف 5 مل من DMEM الدافئ مسبقا ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وشفط المادة الطافية.
   4. أعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من DMEM وانقل المحلول إلى طبق بتري 90 مم.
   5. تحت المجهر ، التقط 10-100 عضوية من الورم باستخدام ماصة P200 الدقيقة واجمعها في أنبوب دقيق على الجليد.
   6. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية بعناية.
   7. حافظ على حبيبات الخلية على الجليد حتى تصبح الفئران جاهزة للجراحة.
2. زرع جدار المثانة تحت المخاطية
   1. قم بإعداد ذكر فأر عاري يبلغ من العمر 8 إلى 10 أسابيع (CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl) قبل أسبوع واحد على الأقل من التجربة للسماح له بالتأقلم مع بيئة جديدة. حقن الإنروفلوكساسين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل 24 ساعة من الجراحة.
   2. نظف سطح المقعد بالماء والصابون. الأوتوكلاف للأدوات الجراحية قبل العملية الجراحية وإجراء الجراحة باستخدام أدوات معقمة.
   3. احتفظ بحقنة الأنسولين 29 جم وأطراف الماصة ومصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تطبيق كيتوبروفين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل إعطاء التخدير.
   4. تخدير الفأر بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران في غرفة الحث. بمجرد تحقيق التخدير العام ، ضع الفأر في وضع ضعيف وحافظ على التخدير عن طريق استنشاق قناع 2٪ من الأيزوفلوران ><المتبخر. ملاحظه: إذا كان وقت التخدير أكثر من 30 دقيقة ، ضع مرهم العين على كلتا العينين باستخدام قطعة قطن لتجنب جفاف القرنية.
   5. ضع بوفيدون اليود بشاش معقم وامسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول. كرر 3 مرات بشاش جديد أو قطعة قطن في كل مرة.
   6. قم بتغطية فتحة الشرج والمجال الجراحي باستخدام ستائر جراحية معقمة يمكن التخلص منها.
   7. باستخدام مجهر تشريح للتكبير ، قم بعمل شق عرضي صغير (أصغر من 1.5 سم) في الجلد والجدار العضلي لأسفل خط الوسط للبطن بمقص جراحي معقم. كشف المثانة من تجويف البطن وادعمها بمسحات قطنية مبللة بالمحلول الملحي.
      ملاحظه: إذا كانت المثانة مليئة بالبول ، فاضغط برفق على المثانة لفك ضغطها قليلا.
   8. أعد تعليق الكريات العضوية في 80 ميكرولتر من الوسط العضوي الذي يحتوي على 50٪ مصفوفة غشاء قاعدي عالية التركيز (الجدول 1 وجدول المواد).
   9. حقن المعلق العضوي في الجانب الأمامي من قبة المثانة باستخدام حقنة الأنسولين 29 جم تحت مجهر تشريح.
   10. أغلق الطبقة الداخلية من جدار البطن بخياطة قابلة للامتصاص مضادة للبكتيريا ثم أغلق الطبقة الخارجية بخياطة 4-0 نايلون. تطهير موقع الجراحة بالبوفيدون واليود و 70٪ الإيثانول.
   11. اسمح للماوس بالتعافي تحت شعاع الأشعة تحت الحمراء لمدة 10-15 دقيقة. راقب الماوس حتى يستعيد وعيه وحركته.
   12. بعد يوم واحد من الجراحة ، تحقق من الحالة العامة للفأر والتسرب المفاغرة. تطبيق كيتوبروفين (5 ملغ/كغ) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة وعلاج الإنروفلوكساسين (5 ملغ/كغ) مرة واحدة يوميا لمدة 10 أيام بعد الجراحة.
   13. عندما يلتئم موقع الشق (10-14 يوما بعد الجراحة) ، قم بإزالة الغرز. راقب نمو ورم المثانة الفأرية لمدة 2-3 أسابيع بعد الحقن العضوي للورم.
   14. إذا لوحظ نمو ورم المثانة ، فقم بالقتل الرحيم للفأر باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون ، وحصاد ورم المثانة بالكامل. اغسله باستخدام DPBS البارد (الشكل 1 ب).
   15. لتحليل أنسجة ورم المثانة ، قم بتلطيخ الجزء المدمج في البارافين من الأنسجة باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) (الشكل 1 ب).

وسط عضوي ورم المثانة الفأر DMEM / F-12 المتقدم (الوسيط الأساسي) 10 ملي مولار HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) 10 ملي نيكوتيناميد مكمل غذائي خال من المصل 0.5x 2 ملي ل-ألانيل-ل-الجلوتامين ثنائي الببتيد 1٪ بنسلين / ستربتومايسين 1 ملي مولار N-acetyl-L-السيستين 50 نانوغرام / مل عامل نمو بشرة الفئران 1 ميكرومتر أمبير 83-01

الجدول 1: تكوين الوسط العضوي لورم المثانة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: زرع تقويم العظام لعضيات ورم المثانة.(أ) رسم تخطيطي لزرع تقويم العضيات الورمية في المثانة إلى فأر عاري. (ب) صور تمثيلية للمثانات والأقسام الملطخة ب H & E من الفئران المزروعة تقويما مع عضيات ورم المثانة. تظهر المناظر المكبرة للمناطق المعبأة في اللوحات الوسطى في اللوحات اليسرى. شريط المقياس = 500 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 مل أنبوب مخروطي الاسكتلندي 50015 طبق 24 بئر كورنينج 3526 29 جم 1/2 حقنة أنسولين شينا B299473538 50 مل أنبوب مخروطي الاسكتلندي 50050 أ 8301 توكرس 2939 تركيز المخزون: 25 ملي الإيثانول المطلق دايجونج 4023-2304 خياطة قابلة للامتصاص هنري شاين 039010 متقدم DMEM / F-12 الحراريه 12634028 CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl (ماوس عاري) نهر تشارلز 194 الكولاجيناز النوع الأول الحراريه 17100017 تركيز المخزون: 20 مجم / مل الكولاجيناز النوع الثاني الحراريه 17100015 تركيز المخزون: 20 مجم / مل كولاجيناز / dispase سيغما 10269638001 تركيز المخزون: 1 مجم / مل DMEM (الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المعدلة من Dulbecco) جيبكو 11965-118 DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) سيغما د8418 DPBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) [ولجن] رطل 001-02 انخفاض عامل نمو Matrigel (GFR) عامل النمو (GFR) (GFR) كورنينج 354230 استخدم للثقافة العضوية في الطبق تركيز عال Matrigel (HC) كورنينج 354248 استخدم لزراعة الأعضاء 1.5 مل أنبوب دقيق أكسايجن MCT-150-C شفرة الحلاقة عازلة المياه المالحة جي دبليو للأدوية التربسين EDTA (0.25٪) جيبكو 25200072 أنبوب الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر 331372 Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد أبمول م 1817 تركيز المخزون: 10 ملم