أخذ عينات الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة: تقنية قائمة على المسبار لاستخراج العينات من أنسجة الكسب غير المشروع

الملخص

المصدر: Stryjak، I. et al. باستخدام خزعة كيميائية لتقييم جودة الكسب غير المشروع. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح استخراج مستقلبات مستقلبات من كلية متبرع تم حصادها مسبقا على أساس مسبار SPME. يمكن استخدام المستقلبات المستخرجة لإجراء تحليل الأيض والدهون من أجل تقييم جودة الأعضاء للزرع.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. إعداد المجسات

1. تحضير مجسات سبائك التيتانيوم والنيكل (طول 40 مم ؛ قطر 0.2 مم) مطلية بمادة ماصة 7 مم. يعتمد عدد المجسات على النقاط الزمنية المستهدفة أثناء الإجراء بأكمله وعدد التكرارات (يوصى ب 3 لكل نقطة زمنية).
   ملاحظه: يمكن تعديل طول ونوع مرحلة الاستخراج بناء على طريقة الدراسة وقطبية المستقلبات ومصفوفة العينة.
2. تحضير خليط تنظيف يتكون من 2: 1 كلوروفورم: الميثانول (v / v). ماصة 1.0 مل من المحلول لكل قارورة زجاجية سعة 2.0 مل وضع مسبارا واحدا ، تم اختراقه مسبقا من خلال الغطاء ، في كل قارورة.
   ملاحظه: قبل الاستخدام ، نظف جميع المجسات لإزالة الجسيمات الملوثة.
3. ضع القوارير على المحرض واضبط سرعة التحريض على 1,200 دورة في الدقيقة. بعد 45 دقيقة ، أوقف الجهاز واشطف الطلاء بماء LC-MS.
4. نظرا لأن الطلاءات يجب أن تخضع لخطوة تكييف مسبقة لتنشيطها ، فقم بإعداد خليط مكيف مسبق يتكون من 1: 1 ميثانول: ماء (v / v). ماصة 1.0 مل من المحلول لكل قارورة زجاجية سعة 2.0 مل وضع مسبار واحد ، تم ثقبه مسبقا من خلال الغطاء ، في كل قارورة.
5. ضع القوارير على المحرض الدوامي واضبط سرعة التحريك على 1,200 دورة في الدقيقة.
6. بعد 60 دقيقة ، أوقف المحرض واشطف الطلاء بماء LC-MS.
7. تعقيم المجسات وفقا لبروتوكول تعقيم المعدات الجراحية القياسي.

< p class = "jove_title" >2. الاستخراج

1. افتح العبوة المعقمة مباشرة قبل أخذ العينات لضمان بيئة معقمة.
2. أدخل مجسين مباشرة في قشرة الكلى لمدة 10 دقائق في كل نقطة زمنية. يجب تغطية طول الطلاء بالكامل بواسطة مصفوفة الأنسجة ؛ لا توجد زاوية محددة مطلوبة ، ولكن حوالي 90 درجة عادة ما يتم استخدامها.
   ملاحظه: يتبع الإجراء الطبي بأكمله البروتوكولات القياسية في مؤسسة معينة. ولا ينظر في أي تعديل بشأن أخذ عينات من الشركة السعودية للمواد القياسية. يتضمن الإجراء النقاط الزمنية الست التالية لأخذ العينات: أ) قبل استئصال الكلى ، في الجسم الحي من المتبرع ؛ ب) – ه) بعد 1 ح, 3 ح, 5 ح, 7 ساعات من نضح الكلى, خارج الجسم الحي في غرفة الجهاز; و) بعد إعادة التروية ، في الجسم الحي من المتلقي.
3. اسحب المجسات عن طريق سحبها من الأنسجة ثم اشطف الطلاءات بماء LC-MS لإزالة أي دم متبقي من سطح الطلاء. اشطفه بعيدا عن موقع الجراحة ، وبعد إزالة المجسات مباشرة.

3. النقل والتخزين

1. ضع المجسات في قوارير منفصلة وأغلقها.
2. ضع القوارير في صندوق من الستايروفوم مملوء بالثلج الجاف أو في النيتروجين السائل للنقل.
3. قم بتخزين العينات في الفريزر (-80 درجة مئوية) ، أو ابدأ على الفور في خطوة الامتصاص.

< p class = "jove_title" >4. الامتصاص

1. تحضير محاليل الامتصاص المكونة من 80:20 أسيتونيتريل: ماء (v / v) لتحليل التمثيل الغذائي ، و 1: 1 isopropanol: methanol (v / v) لتحليل الدهون.
2. ماصة 100 ميكرولتر من المحلول لإدخالها في قوارير مسمى سعة 2.0 مل ووضع مسبار واحد، سبق ثقبه من خلال الغطاء، في كل قارورة.
3. ضع القوارير على المحرض الدوامي واضبط سرعة التحريك على 1,200 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة.
4. قم بإزالة المجسات من القوارير. المقتطفات التي تم الحصول عليها جاهزة الآن للتحليل الآلي.

< p class = "jove_title" >5. تحليل LC-MS

1. ضع قوارير تحتوي على مستخلصات في جهاز أخذ العينات الآلي لنظام LC-MS.
   ملاحظه: تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة (RP ، HILIC) إلى جانب قياس الطيف الكتلي عالي الدقة ومحلل كتلة أوربيتراب في هذه الدراسة. للحصول على معلمات تحليل التمثيل الغذائي ، انتقل إلى الخطوة 5.2. للحصول على معلمات تحليل الدهون ، انتقل إلى الخطوة 5.6.
2. استخدم عمود خماسي فلوروفينيل (PFP) (2.1 مم × 100 مم ، 3 ميكرومتر) لفصل الطور العكسي.
   1. اضبط معدل التدفق على 300 ميكرولتر / دقيقة ، ودرجات حرارة جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي والعمود على 4 درجات مئوية و 25 درجة مئوية ، على التوالي.
   2. قم بإعداد المراحل المتنقلة وفقا للنسب التالية: المرحلة المتنقلة أ: الماء: حمض الفورميك (99.9: 0.1 ، الخامس / الحجم) ، والمرحلة المتنقلة ب: الأسيتونيتريل: حمض الفورميك (99.9: 0.1 ، الخامس / الحجم). اضبط تدفق الطور المتحرك وفقا للمعلمات التالية: بدء تدفق الطور المتحرك (0-3 دقائق): 100٪ A متبوعا بتدرج خطي إلى 10٪ A (3-25 دقيقة) ، وينتهي بالتدفق المتساوي 10٪ A حتى 34 دقيقة ، متبوعا ب 6 دقائق من وقت إعادة توازن العمود.
3. لفصل HILIC ، استخدم عمود HILIC (2.0 مم × 100 مم ، 3 ميكرومتر ، 200 أمبير). اضبط معدل التدفق على 400 ميكرولتر / دقيقة.
   1. تحضير المراحل المتنقلة وفقا للنسب التالية: المرحلة المتنقلة أ: الأسيتونيتريل: عازلة أسيتات الأمونيوم (9: 1 ، حجم / حجم ، تركيز الملح الفعال 20 مليمتر) ، المرحلة المتنقلة ب: الأسيتونيتريل: عازلة أسيتات الأمونيوم (1: 1 ، حجم / حجم ، تركيز الملح الفعال 20 مليمتر).
   2. اضبط تدفق الطور المتحرك وفقا للمعلمات التالية: ابدأ تدفق الطور المتحرك (0-3 دقائق) عند 100٪ A ، واضغط لمدة 3.0 دقيقة ثم المنحدر إلى 100٪ B في غضون 5 دقائق.
4. اضبط نطاق المسح الضوئي على 85-1000 م / ز. اضبط معلمات مصدر أيون HESI في وضع التأين الإيجابي على: جهد الرش 1,500 فولت ، درجة حرارة الشعيرات الدموية 300 درجة مئوية ، غاز الغلاف 40 أمبير ، معدل تدفق غاز aux 15 a.u. ، درجة حرارة سخان المسبار 300 درجة مئوية ، مستوى S-Lens RF 55٪.
5. قم بتشغيل عينات مراقبة الجودة المكونة من 10 ميكرولتر من كل عينة تم تحليلها (بانتظام ، كل 10-12 عينة) لمراقبة أداء الأجهزة.
6. لفصل الطور العكسي ، استخدم عمود C18 (2.1 مم × 75 مم ، 3.5 ميكرومتر).
   1. اضبط معدل التدفق على 200 ميكرولتر / دقيقة ، ودرجات حرارة جهاز أخذ العينات التلقائية والعمود على 4 درجات مئوية و 55 درجة مئوية ، على التوالي. تحضير المراحل المتنقلة وفقا للنسب التالية: المرحلة المتنقلة A: H₂O: MeOH (60: 40 ، v / v) ، 10 ملي مولار أسيتات الأمونيوم و 1 ملي مولار حمض الخليك. المرحلة المتنقلة ب: IPA: MeOH (90:10 ، حجم / حجم) ، 10 ملي مولار أسيتات الأمونيوم و 1 ملي مولار حمض الخليك.
   2. اضبط تدفق الطور المتنقل وفقا للمعلمات التالية: 0-1 دقيقة (20٪ B) ، 1-1.5 دقيقة (20-50٪ B) ، 1.5-7.5 دقيقة (50-70٪ B) ، 7.5-13 دقيقة (70-95٪ B) ، 13-17 دقيقة (95٪ B) ، 17-17.1 دقيقة (95-20٪ B) ، 17.1-23 دقيقة (20٪).
7. لفصل HILIC ، استخدم عمود HILIC (100 × 2.1 مم ، 3 ميكرومتر).
   1. اضبط معدل التدفق على 400 ميكرولتر / دقيقة ، ودرجات حرارة جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي والعمود على 4 درجات مئوية و 40 درجة مئوية ، على التوالي.
   2. تحضير المراحل المتنقلة وفقا للنسب التالية: المرحلة المتنقلة A: ACN ؛ المرحلة المتنقلة B: 5 ملي مولار أسيتات الأمونيوم في الماء. اضبط تدفق الطور المتنقل وفقا للمعلمات التالية: 0-2 دقيقة (96٪ B) ، 2-15 دقيقة (96-80٪ B) ، 15-15.1 دقيقة (80-96٪ B) ، 15.1-21 دقيقة (96٪ B).
8. اضبط معلمات مصدر أيون HESI في وضع التأين الإيجابي لرش الجهد 3,500 فولت ، ودرجة حرارة الشعيرات الدموية 275 درجة مئوية ، وغاز الغمد 20 أمبير ، ومعدل تدفق غاز aux 10 a.u. ، ودرجة حرارة سخان المسبار 300 درجة مئوية ، ومستوى S-Lens RF 55٪.
9. قم بتشغيل عينات مراقبة الجودة المكونة من 10 ميكرولتر من كل عينة تم تحليلها (كل 10-12 عينة) لمراقبة أداء الأداة.
10. إجراء الحصول على البيانات في برنامج متوافق مع الأداة.

6. تحليل البيانات

1. إجراء معالجة البيانات وتحديد الهوية المفترضة والتحليل الإحصائي باستخدام برنامج مخصص لتحليل التمثيل الغذائي والدهون غير المستهدف.
   ملاحظه: يمكن الحصول على تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ومخططات الشعيرات الصندوقية لتصور بنية البيانات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض الخليك ميرك 5330010050 مادة مضافة للمرحلة المتنقلة أسيتونيتريل الكيم 696-34967-4X2.5L مذيب HPLC أسيتات الأمونيوم ميرك 5330040050 مادة مضافة للمرحلة المتنقلة BENCHMIXER XL دوامة متعددة الأنابيب المعيار العلمي BV1010 خلاط دوامة قبعات بيرلان تكنولوجيز 5183-2076 الأزرق scrw tp ، PTFE / Si spta قبل الشق ، 100PK كلوروفورم ميرك 1024441000 خرطوشة ديسكفري HS F5 Supelguard، 3 ميكرومتر، L × ID 2 سم × 2.1 مم ميرك 567570-U عمود حماية HPLC ديسكڤري HS F5، 2.1 مم × 100 مم، 3 ميكرومتر ميرك 567502-U عمود HPLC حمض الفورميك الكيم 497-94318-50 مل مادة مضافة للمرحلة المتنقلة قوارير زجاجية بيرلان تكنولوجيز 5182-0714 HILIC Luna 3 ميكرومتر ، 200 أمبير ، 100 × 2.0 مم شيم بول PHX-00D-4449-B0 عمود HPLC خرطوشة HILIC SecurityGuard ، 3 ميكرومتر ، 4 × 2.0 مم شيم بول PHX-AJ0-8328 عمود حماية HPLC إيزوبوبانول الكيم 231-AL03262500 مذيب HPLC ميثانول الكيم 696-34966-4X2.5L مذيب HPLC مياه نقية نانوية ميرك 1037281002 مذيب HPLC Q Exactive Focus الهجين رباعي الأقطاب Orbitrap MS الترمو: العلمية س: التركيز الصارم مطياف الكتلة SeQuant ZIC-cHILIC 3 ميكرومتر ، 100 å 100 × 2.1 مم ميرك 1506570001 عمود HPLC مجموعة الحماية SeQuant ZIC-HILIC 20 × 2.1 مم ميرك 1504360001 عمود حماية HPLC مجسات الألياف SPME LC ، الوضع المختلط سوبيلكو ألياف النموذج الأولي أنظمة UltiMate 3000 HPLC الترمو: العلمية الطراز UltiMate 3000 نظام HPLC إدراج قارورة (غير مفعلة) بيرلان تكنولوجيز 5181-8872 XSelect CSH C18 3.5 ميكرومتر 2.1 × 75 مم المياه 186005644 عمود HPLC خرطوشة XSelect CSH C18 VanGuard 3.5 ميكرومتر ، 2.1 × 5 مم المياه 186007811 عمود حماية HPLC