مقالة منهجية

تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية: طريقة لتحديد الحمض النووي خارج الخلية في أقسام أنسجة FFPE

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: O'Sullivan ، K. M. et al. التعلم الآلي الخاضع للإشراف للقياس شبه الكمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب كبيبات الكلى J. Vis. (2020)

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية في أقسام أنسجة FFPE. يمكن قياس الحمض النووي الملون خارج الخلية لتحديد فعالية أي علاج علاجي يؤدي إلى موت الخلايا السرطانية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تلطيخ ecDNA باستخدام DAPI و β-Actin

  1. ضع الشرائح الزجاجية في رف منزلق في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  2. اغمر الشرائح في تغييرين من المذيبات (الزيلين أو البديل) لمدة 40 دقيقة لكل منهما ، في غطاء الدخان.
  3. أعد الترطيب في 100٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، و 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. يغسل لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور.
  4. ضع لوحا ساخنا في شفاط الدخان ومحلول استرجاع المستضد قبل الغليان (10 ملي تريس ، 1 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 9.0) في قدر الضغط. بمجرد أن يبدأ محلول استرجاع المستضد في الغليان ، ضع الشرائح في القدر أفقيا باستخدام زوج من الملقط وأغلق الغطاء. يغلي على نار عالية (ما يعادل 15 رطل لكل بوصة مربعة أو 103 كيلو باسكال) لمدة 10 دقائق < / > ملاحظه: هذه الخطوة حاسمة لأنها تستعيد المستضد محل الاهتمام عن طريق الكشف عن حاتمة المستضد (المتشابكة عبر تثبيت الفورمالين) للسماح بالارتباط الخاص بالجسم المضاد للحاتمة. لن يعمل التلوين اللاحق بدونه.
  5. ارفعي قدر الضغط عن النار وأزيلي الغطاء على الفور عن طريق تشغيل الصنبور البارد فوق الغطاء في الحوض. اترك الشرائح لتتوازن لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد.
  6. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بسعة 0.01 M (PBS) (درجة الحموضة 7.4) على شاكر مداري.
  7. استخدم قلما كارها للماء لرسم دوائر حول أنسجة الكلى ، مع الحرص على عدم ترك أي أنسجة تجف في هذا الوقت.
  8. كتلة الأنسجة في مصل الدجاج بنسبة 10٪ في 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) / PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 م) لمدة 30 دقيقة ، 60 ميكرولتر لكل قسم. لا تغسل بعد هذه الخطوة ولكن قم بإزالة محلول الانسداد بعناية باستخدام ماصة سعة 60 ميكرولتر ، ولا تدع الأقسام تجف.
  9. ضع كوكتيل الأجسام المضادة الأولية ل β أكتين مخفف 1/1000 في 1٪ BSA / PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 م) ، 60 ميكرولتر لكل قسم واحتضانه طوال الليل في غرفة الرطوبة عند 4 درجات مئوية.
  10. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 م) على شاكر مداري.
  11. ضع الجسم المضاد الثانوي ، الدجاج المضاد للأرانب 488 (1/200) ، 60 ميكرولتر لكل قسم مخفف في 1٪ BSA / PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 0.01 م) لمدة 40 دقيقة في RT.
  12. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 م) على شاكر مداري.
  13. اغمر الشرائح في 0.3٪ سودان أسود في 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة في جرة كوبلين.
    ملاحظه: هذه الخطوة مهمة لأنها تروي التألق الذاتي الناجم عن تثبيت الفورمالين.
  14. اغسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة الرواسب ثم اغمرها في PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 م) لمدة 10 دقائق لمنع تكون المزيد من الرواسب السوداء السودانية.
  15. قم بتركيب الشرائح على أغطية زجاجية متحدة البؤر باستخدام ثلاث قطرات سعة 60 ميكرولتر من محلول التثبيت باستخدام DAPI وقم بإغلاق الغطاء بطلاء الأظافر عن طريق وضعه حول محيط الغطاء.
  16. اسمح للشرائح بالمعالجة لمدة 24 ساعة في RT (للسماح ل DAPI بالاختراق) ثم تخزينها عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظه: من المهم البقاء في الظلام لمنع تلاشي مجسات الفلورسنت.
  17. تنزلق الصورة باستخدام رأس مسح ليزر متحد البؤر متصل بالمجهر. قم بإثارة الشرائح باستخدام ليزر 405 ل DAPI و 488 Laser ل Beta Actin. التقط صورا أحادية المستوى بدقة 1024 × 1024 بكسل باستخدام التقاط خط متسلسل ومتوسط 4 أسطر ، وهو أمر ضروري للكشف عن ecDNA. يتم استخدام هدف النفط 40x 1.0 NA.
    1. صور ما لا يقل عن 20 كبيبة لكل عينة. حفظ الصور كملفات ND2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 2153 تتكون محاليل 5٪ و 1٪ في PBS ، ويمكن تصنيعها بكميات كبيرة وتجميدها - تخلص منها بمجرد إذابتها الجسم المضاد للماعز IgG (H + L) المضاد المتصاص للدجاج Alexa Fluor 594 ثيرموفيشر العلمي أ -21468 قم بالتدوير في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 1 دقيقة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل الأجسام المضادة الجسم المضاد للدجاج المضاد للفأر IgG (H + L) الممتص ، Alex Fluor 647 ثيرموفيشر العلمي أ -121468 قم بالتدوير في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 1 دقيقة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل الأجسام المضادة الدجاج المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الممتص عبر Alexa Fluor 488 ثيرموفيشر العلمي أ -21441 قم بالتدوير في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 1 دقيقة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل الأجسام المضادة سيرا الدجاج سيغما سي 5405 يتكون من 1٪ BSA / PBS أغطية 24x60 مم علم أذربيجان ES0107222 # 1.5 هذا ليس سماكة قياسية مصممة للاستخدام في الفحص المجهري متحد البؤر EDTA 10 مللي متر سيغما E6758 أضف TRIS و EDTA معا في الماء المقطر ودرجة الحموضة إلى 9 ، لاسترجاع المستضد ، يمكن تكوينها في محلول 10x الإيثانول 30٪ و 70٪ و 100٪ توريد الكيماويات رقم 1170 يتم توفيره على شكل إيثانول غير مشوه بنسبة 100٪ - مخفف إلى 30٪ و 70٪ باستخدام الماء المقطر الفورمالديهايد، 4٪ (10٪ فورمالين محايد مخزن) تراجان NBF-500 يتم وضع الكلى في أنبوب 5 مل يحتوي على 3 مل من الفورمالين لمدة 16 ساعة في RT ، ويجب استخدام الفورمالين في غطاء الدخان شرائح الأنسجة الزجاجية - Ultra Super Frost ، Menzel Glaze ، 25x75 x1.0mm تراجان J3800AM4 يعد استخدام الشرائح المطلية المشحونة الموجبة أمرا ضروريا. لا نوصي باستخدام بولي إل ليسين لطلاء الشرائح حيث تزيح الأنسجة من الشرائح أثناء خطوة استرجاع المستضد الماعز المضادة للإنسان / الفأر MPO المضادة البحث والتطوير أف3667 Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول قلم مسعور مختبرات فيكتور إتش-400 يستخدم لرسم دائرة حول أنسجة الكلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيغما ص38135 0.01 مليون PB / 0.09٪ كلوريد الصوديوم مكياج 5 لتر في المرة الواحدة قدر ضغط 6 لتر تيفال سيكيور 5 نيو استانلس ستيل تيفال GSA-P2530738 تم شراؤها من متجر الأدوات المنزلية المحلي إطالة الذهب DAPI تقنيات الحياة ص 36962 ضع القطرات مباشرة على الغطاء الأرنب المضاد للإنسان / الفأر بيتا أكتين الأجسام المضادة أبكام أب8227 Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول الأرنب المضاد للإنسان / الفأر H3Cit المضاد أبكام أب 5103 Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول تلطيخ الرف 24 شريحة بروسيتك H4465 يجب أن يكون رف التلوين المختار قادرا على تحمل الغليان تحت الضغط والحضانة في فرن 60 درجة سودان بلاك ب سيغما 199664 0.3٪ أضف 3 جم إلى زجاجة سعة 1 لتر في 70٪ إيثانول ، وقم بالتصفية والحماية من الضوء - مستقرة لمدة 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة تريس 10 ملم سيغما تي 4661 أضف TRIS و EDTA معا في الماء المقطر ودرجة الحموضة إلى 9 ، لاسترجاع المستضد ، يمكن تكوينها في محلول 10x الزيلين تراجان XL005 / 20 يجب استخدامه في غطاء الدخان

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DAPI

مقالات ذات صلة