اشتقاق خلايا الكلى البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات: إجراء للتمايز الموجه لخلايا الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية

الملخص

المصدر: Burt ، M. et al. التمايز الموجه لخلايا الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية في ظل ظروف محددة كيميائيا. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكول اشتقاق خلايا الكلى البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من خلال تمايز الخلايا في ظل ظروف كيميائية محددة. يمكن استخدام الخلايا البودوية المتولدة لاختبار السمية الكلوية ونمذجة المرض.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

1. تمييع 5x hiPS الملحق المذاب في الوسط القاعدي لثقافة الخلايا hiPS للحصول على محلول 1x من hiPS CCM.
   ملاحظه: يتطلب مكمل hiPS CCM المجمد 5x عملية ذوبان بطيئة ، ويفضل أن تكون في 4 درجات مئوية طوال الليل. يمكن تخزين حصصات 1x hiPS CCM لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية.
2. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي (BM) الألواح المطلية ب 1 لزراعة خلايا hiPS: قم بإذابة مصفوفة BM 1 بين عشية وضحاها على الجليد عند 4 درجات مئوية. بمجرد إذابتها ، قم بإعداد الحصص مع عوامل التخفيف المناسبة على النحو المقترح من قبل الشركة المصنعة.
   ملاحظه: عادة ، يتم تحضير الحصص للتخفيف اللاحق في 25 مل من DMEM / F12 البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل متبوعا بخلط شامل لإذابة مصفوفة BM 1 تماما وتجنب تكوين البلورات المتبقية.
3. انقل 1 مل من محلول مصفوفة BM 1 إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل ، ملفوفة في غشاء البارافين. يمكن تخزين الألواح المطلية بمصفوفة BM 1 عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
4. تحضير الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي (BM) 2: قم بتخفيف الكميات المناسبة من مصفوفة BM 2 في 9 مل من الماء المقطر المعقم لتحضير تركيز نهائي يبلغ 5 ميكروغرام / مل. أضف 700 ميكرولتر من محلول مصفوفة BM 2 إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإعداد 100 ميكروغرام / مل من محاليل المخزون لكل من BMP7 و Activin A و VEGF على النحو التالي: أعد تكوين BMP7 في الماء المقطر المعقم الذي يحتوي على 0.1٪ (بالوزن / الحجم) BSA وإعادة تكوين Activin A و VEGF بشكل منفصل في PBS معقم يحتوي على 0.1٪ (الوزن / الحجم) BSA. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من كل محلول مخزون وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
6. قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي من Y27632 عن طريق إذابة 10 مجم من Y27632 في 3.079 مل من الماء المقطر المعقم. Aliquot 100 ميكرولتر من المرق وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
7. قم بإذابة 2 مجم من CHIR99021 في 143.4 ميكرولتر من DMSO المعقم لتحضير محلول مخزون 30 ملم. قم بإعداد 5 ميكرولتر من الكميات وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد (أو وفقا لتوصية الشركة المصنعة).
8. قم بإذابة 10 ملغ من حمض الريتينويك المتحول بالكامل في 3.33 مل DMSO معقم. تحضير 500 ميكرولتر من الحصص وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد الإعلام الثقافي

1. قم بإعداد وسط تمايز الأديم المتوسط عن طريق إعادة تكوين محاليل المخزون المقابلة إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / مل أكتيفين أ ، و 3 ميكرومتر CHIR99021 ، و 10 ميكرومتر Y27632 ، و 1x B27 مكمل خال من المصل بحجم مناسب من DMEM / 12 مع مكمل الجلوتامين.
   ملاحظه: يجب تحضير وسط تمايز الأديم المتوسط حديثا قبل خطوات التمايز وبحجم مناسب لحجم التجربة (عادة ما يكون 50 مل من الوسط كافيا للوحين من 12 بئرا).
2. قم بإعداد وسيط تمايز الأديم المتوسط عن طريق إعادة تكوين محاليل المخزون المقابلة إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام / مل BMP7 و 3 ميكرومتر CHIR99021 و 1x B27 مكمل خال من المصل في DMEM / F12 مع مكمل الجلوتامين.
   ملاحظه: إذا لزم الأمر ، يمكن استكمال الوسيط بنسبة 1٪ (vol / vol) بنسلين ستربتومايسين. اضبط حجم الوسط باستخدام DMEM / F12 مع مكمل الجلوتامين. يمكن تحضير هذه الوسيلة على دفعات كبيرة ؛ ومع ذلك ، يوصى بتخزينها في حصص أصغر (على سبيل المثال ، 45 مل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل) لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. يمكن تخزين هذه الوسائط عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر ويمكن إذابتها عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل الاستخدام.
3. تحضير وسط تحريض الخلايا البودوية عن طريق إعادة التكوين إلى تركيز نهائي 100 نانوغرام / مل BMP7 ، 100 نانوغرام / مل أكتيفين أ ، 50 نانوغرام / مل VEGF ، 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 1x B27 مكمل خال من المصل ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك المتحول بالكامل في DMEM / F12 مع مكمل الجلوتامين. حماية الوسط من الضوء (على سبيل المثال ، عن طريق لف الحاوية بورق رقائق معدنية).
   ملاحظه: يمكن تحضير هذه الوسيلة على دفعات كبيرة وتخزينها في الظلام عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. يجب إذابة الكميات المجمدة طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
4. قم بإعداد 25 مل من محلول تحييد التربسين عن طريق إضافة 10٪ (حجم / حجم) FBS معطل بالحرارة في DMEM / F12 والفلتر في ظروف معقمة.
5. لصيانة ما بعد التمايز للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية ، قم بإعداد وسيط كامل مع وسائط صيانة الخلايا البودوية عن طريق إضافة المكمل إلى الوسط القاعدي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

< p class = "jove_title" >3. ثقافة خلايا hiPS خالية من المغذيات باستخدام وسيط ثقافة خلية hiPS

1. استنشق المحلول المتبقي لمصفوفة BM 1 من الألواح المطلية مسبقا واغسل الآبار 3 مرات ب 1 إلى 2 مل من DMEM / F12 الدافئ.
2. ينفق الشفط hiPS CCM من خلايا hiPS ويشطف الخلايا 3 مرات باستخدام DMEM / F12 الدافئ. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئة واحتضنه لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية للمساعدة في تفكيك الخلايا. قم بإجراء فحص بصري للخلايا تحت مجهر زراعة الأنسجة وتأكد من أن حواف مستعمرات الخلايا تبدو مستديرة ، ثم قم بشفط محلول انفصال الخلية بسرعة من الخلايا (التأكد من أن مستعمرات الخلايا لا تزال متصلة باللوحة ، وإن كان ذلك بشكل فضفاض). اشطف الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام DMEM / F12 لإزالة محلول انفصال الخلايا.
3. أضف 3 مل من hiPS CCM إلى خلايا hiPS (في كل بئر من صفيحة 6 آبار) التي تمت معالجتها بمحلول انفصال الخلية. اكشط المستعمرات باستخدام رافع الخلايا ، وقم بتعليق خلايا الماصة برفق لأعلى ولأسفل لإخراج الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض. اغسل الطبق جيدا للتأكد من حصاد جميع الخلايا.
   ملاحظه: يوصى باستخدام ماصة سعة 5 مل لتجنب القص الزائد على الخلايا.
4. انقل 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار مصفوفة BM جديدة مطلية ب 1 تحتوي على 2 مل من hiPS CCM لكل بئر. حرك اللوحة بطريقة الشكل الثامن لتوزيع مستعمرات الخلايا داخل الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪. قم بتحديث الوسط يوميا حتى تصبح الخلايا جاهزة للمرور أو استخدامها في تجربة التمايز (حوالي 70٪ التقاء).
   ملاحظه: حجم المستعمرة المثالي للمرور الروتيني ل iPSCs بين 200-500 ميكرومتر في ظل ظروف خالية من المغذيات باستخدام hiPS CCM (بدون مثبط ROCK). إذا تم فردية الخلايا أثناء العلاج بإنزيمات التفكك أو المخازن المؤقتة ، فيمكن استكمال hiPS CCM بمثبط ROCK (على سبيل المثال ، 10 ميكرومتر Y27632) لتحسين بقاء الخلية.

< p class = "jove_title" >4. تمايز خلايا hiPS إلى خلايا الأديم المتوسط (الأيام 0-2)

1. في حين أن مزارع خلايا hiPS في مرحلة النمو الأسي (تقريبا في غضون 4 أيام من الثقافة بعد المرور ، وحوالي 70٪ من التقاء) ، افحص بصريا وجود خلايا متمايزة تلقائيا داخل وحول حواف المستعمرات. إذا لزم الأمر ، كشط مناطق التمايز بشكل معهم.
2. استنشق hiPS CCM من خلايا hiPS واشطف الخلايا 3 مرات باستخدام DMEM / F12 الدافئ. احتضان الخلايا ب 1 مل من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وتحقق من التفكك تحت المجهر. نظرا للاختلافات المتأصلة بين خطوط خلايا hiPS المختلفة ، يجب تحديد وقت الحضانة الفعلي للمخزن المؤقت لتفكك الخلية لخط خلية معين.
3. اكشط البئر برفق باستخدام رافع الخلايا لإخراج الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، متبوعا بسحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات لإضفاء الطابع الشخصي على خلايا hiPS.
   1. قم بإحضار تعليق الخلية إلى حجم 15 مل مع DMEM / F12 الدافئ وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 290 × جم في درجة حرارة الغرفة.
   قم
   2. بشفط المادة الطافية برفق وأعد تعليق الخلايا باستخدام DMEM / F12 الدافئ لجولة أخرى من الطرد المركزي لإزالة مصفوفة BM المتبقية 1 ومكونات المخزن المؤقت للتفكك.
4. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط تحريض الأديم المتوسط كما هو موضح أعلاه. احسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد كولتر لتحديد الحجم المناسب لوسط تمايز الأديم المتوسط الضروري لتحقيق تركيز 1 × 10⁵ خلايا / مل.
5. قم بشفط محلول ECM من الألواح المطلية بمصفوفة BM 2 واشطف الألواح مرتين باستخدام DMEM / F12 الدافئ. امزج معلق خلية hiPS برفق عن طريق سحب العينات عدة مرات. انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من ألواح مصفوفة BM المطلية ب 2 بئر ثم رج الألواح برفق لتوزيع الخلايا بشكل متساو.
6. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂. قم بتحديث وسيط تحريض الأديم المتوسط في اليوم التالي.
   ملاحظه: بعد يومين ، ستكون خلايا الأديم المتوسط المشتقة من خلايا hiPS جاهزة لتحريض الأديم المتوسط الوسيط.

< p class = "jove_title" >5. تمايز خلايا الأديم المتوسط المشتقة من خلايا hiPS إلى الأديم المتوسط المتوسط المتوسط (الأيام 2-16)

1. في اليوم 2 من بروتوكول التمايز ، قم بشفط وسط تحريض الأديم المتوسط وتجديده ب 1 مل لكل وسط تحريض للأديم المتوسط الوسيط.
2. تحديث الوسط كل يوم للحفاظ على عتبة دقيقة لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة للخلايا النشطة الأيضية. إذا كان هناك نمو كبير للخلايا واستنفاد سريع لمغذيات الوسائط (يشار إليه باصفرار الوسائط) ، فيمكن زيادة حجم وسط تمايز الأديم المتوسط الوسيط إلى 1.3 مل لكل بئر من الألواح المكونة من 12 بئرا.
3. زراعة الخلايا لمدة 14 يوما إضافية للحصول على خلايا الأديم المتوسط الوسيطة. بحلول اليوم 16 ، يمكن حفظ هذه الخلايا بالتبريد لاستخدامها لاحقا.

< p class = "jove_title" >6. تمايز خلايا الأديم المتوسط الوسيطة المشتقة من خلايا hiPS إلى خلايا بودوسية (الأيام 16-21)

1. اشطف خلايا الأديم المتوسط الوسيطة باستخدام DMEM / F12 الدافئ متبوعا بحضانة الخلايا ب 0.5 مل لكل بئر بنسبة 0.05٪ تريبسين-EDTA لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإجراء فحص بصري للتأكد من أن الخلايا بدأت في الانفصال.
2. اكشط الخلايا باستخدام رافع الخلايا وماصة تعليق الخلية عدة مرات باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر للحصول على خلايا فردية (أو كتل صغيرة) منها.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، تأكد من أن الخلايا منفصلة تماما لأن الخلايا المجمعة قد تفشل في الحصول على نمط ظاهري متمايز نهائيا ضمن الجدول الزمني للبروتوكول.
3. أضف حوالي 2 مل لكل بئر من محلول التربسين المحايد لإيقاف نشاط التربسين.
4. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ورفع الحجم إلى 50 مل باستخدام DMEM / F12 ، ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 201 × جم في درجة حرارة الغرفة.
5. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط تحريض البودويت. للحصول على أفضل النتائج ، تأكد من كثافة بذر نهائية تبلغ حوالي 100,000 خلية / بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا. أضف تعليق الخلية إلى الألواح المطلية بمصفوفة BM 2 وقم بهز اللوحة برفق للمساعدة في توزيع الخلايا بشكل متساو.
6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وقم بتحديث متوسط يوميا لمدة تصل إلى 5 أيام للحصول على الخلايا البودية بحلول اليوم 21.
   ملاحظه: يمكن الحفاظ على الخلايا القصيرة المشتقة من خلايا hiPS الناتجة في الثقافة لمدة 2-4 أسابيع إضافية باستخدام وسط كامل مع وسائط صيانة الخلايا البودية. بمجرد دخولها إلى وسائط صيانة الخلايا ، يمكن تغذية الخلايا كل يومين ويمكن استخدامها في الدراسات اللاحقة أو التحليلات النهائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا خلايا IPS البشرية DU11 تم إنشاء خط خلايا iPS DU11 (استنساخ جامعة ديوك # 11) في مرفق iPSC الأساسي بجامعة ديوك وقدمه لنا مختبر بورساك في جامعة ديوك. تم اختبار هذا الخط بحثا عن الميكوبلازما وتم آخر تنويط في يوليو 2019 من قبل مختبرنا ، ووجد أنه طبيعي في النمط النووي. عوامل النمو والمكملات الإعلامية حمض الريتينويك المتحولة بالكامل (500 مجم) هاتف: 72262 تقنيات الخلايا الجذعية مكمل B27 الخالي من السيروم 17504044 تقنيات الحرارة / الحياة CHIR99021 04-0004 ستيمجنت قد يظهر تباينا من لوت إلى لوت مجموعة متوسطة كاملة مع
ثقافة-آر 4Z0-500-R أنظمة الخلايا وسائط صيانة الخلايا البودوية DMEM / F12 12634028 تقنيات الحرارة / الحياة DMEM/F12 مع مكمل GlutaMAX 10565042 تقنيات الحرارة / الحياة DMEM/F12 مع مكمل الجلوتامين FBS معطل بالحرارة 10082147 تقنيات الحرارة / الحياة النشط البشري أ PHC9564 تقنيات الحرارة / الحياة BMP7 البشري PHC9544 تقنيات الحرارة / الحياة VEGF البشري PHC9394 تقنيات الحرارة / الحياة mTeSR1 متوسط 05850 تقنيات الخلايا الجذعية وسائط زراعة الخلايا hiPS (CCM) البنسلين الستربتومايسين ، سائل (100×) 15140-163 تقنيات الحرارة / الحياة Y27632 مثبط الصخور 1254 توكرس الاجسام المضاده Alexa Fluor 488- و Alexa Fluor 594 الأجسام المضادة الثانوية المترافقة أ 32744 ؛ أ 32754 ؛ أ -11076 ؛ أ 32790 تقنيات الحرارة / الحياة Brachyury(T) أب20680 أبكام نيفرين GP-N2 بروجين أكتوبر 4 أيه إف 1759 أنظمة البحث والتطوير PAX2 71-6000 إنفيتروجين WT1 MAB4234 ميليبور جزيئات ECM جزء iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) N-892012 إيواي أمريكا الشمالية مصفوفة الغشاء القاعدي (BM) 2 مصفوفة مؤهلة من Matrigel hESC ، قارورة 5 مل 354277 BD Biosciences مصفوفة الغشاء القاعدي (BM) 1. قد يظهر تباينا من لوت إلى لوت الإنزيمات والكواشف الأخرى أكوتاز A1110501 تقنيات الحرارة / الحياة حل انفصال الخلية جيش صرب البوسنه أ 9418 سيجما ألدريتش ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) د2438 سيجما ألدريتش DMSO سام. يجب التعامل معها في غطاء الأمان الكيميائي المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم ، ملح هانك المتوازن 13150016 تقنيات الحرارة / الحياة محلول الإيثانول ، 70٪ (حجم / حجم) ، درجة التكنولوجيا الحيوية هاتف: 97065-058 VWR الإيثانول قابل للاشتعال وسام FBS 431097 كورنينج بارافورمالدهايد (PFA) هاتف 28906 تقنيات الحرارة / الحياة يجب التعامل مع PFA في غطاء دخان كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات العين الآمنة. تجنب الاستنشاق والتلامس مع الجلد. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 14190-250 تقنيات الحرارة / الحياة الماء المقطر المعقم 15230162 تقنيات الحرارة / الحياة تريتون X-100 97062-208 VWR التربسين EDTA، 0.05٪ 25300-120 تقنيات الحرارة / الحياة معدات ماصات شافطة، ملفوفة بشكل فردي هاتف: 29442-462 كورنينج جهاز طرد مركزي Avanti J-15R ب 99516 بيكمان كولتر أنبوب الطرد المركزي المخروطي ، 15 مل 352097 كورنينج أنبوب الطرد المركزي المخروطي ، 50 مل 352098 كورنينج صناديق التبريد 3395465 تقنيات الحرارة / الحياة لتخزين الحصص المجمدة إيفوس M7000 AMF7000 تقنيات الحرارة / الحياة المجهر الفلوري يستخدم للحصول على صور لخلايا iPS الثابتة والملطخة ومشتقاتها مقياس الدم هاتف: 100503-092 VWR حاضنة Heracell VIOS 160i CO2 51030403 تقنيات الحرارة / الحياة للثقافة الروتينية وصيانة خلايا iPS ومشتقاتها مقلوب Zeiss أكسيو المراقب مجهزة بكاميرا AxioCam 503 491916-0001-000 (مجهر) ;< / > 426558-0000-000(كاميرا) الفحص المجهري لكارل زايس تستخدم للحصول على صور تباين الطور لخلايا iPS الحية ومشتقاتها في كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا البودوية قفازات النتريل كيمبرلي كلارك 40101-346 VWR كيموايب كبيرة هاتف: 21905-049 VWR كيموايب صغيرة هاتف: 21905-026 VWR أطراف ماصة حاجز دقيقة P10 P1096-FR دينفيل العلمية أطراف ماصة حاجز P100 ص 1125 دينفيل العلمية أطراف ماصة حاجز P1000 ص 1126 دينفيل العلمية أطراف ماصة حاجز P20 ص 1121 دينفيل العلمية أطراف ماصة حاجز P200 ص 1122 دينفيل العلمية ماصة مصلية، 10 مل، ملفوفة بشكل فردي 356551 كورنينج ماصة مصلية، 25 مل، ملفوفة بشكل فردي 356525 كورنينج ماصة مصلية، 5 مل، ملفوفة بشكل فردي 356543 كورنينج Steriflip ، 0.22 ميكرومتر ، PES SCGP00525 EMD ميليبور أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة 1138 واط 14 توماس العلمية لنقل عوامل النمو زراعة الأنسجة المعالجة بألواح 12 بئر 353043 كورنينج زراعة الأنسجة المعالجة بألواح 6 آبار 353046 كورنينج معطف مختبر VWR أبيض techuni 10141-342 VWR رافع خلية مشطوف على نطاق واسع 3008 كورنينج