عزل خلايا العضلات الملساء Detrusor: إجراء هضم إنزيمي للحصول على خلايا DSM من عينات المثانة البولية البشرية

الملخص

المصدر: Malysz، J. et al. تحضير واستخدام خلايا العضلات الملساء البشرية المعزولة حديثا لتوصيف التيارات الكاتيونية الحساسة ل 9-phenanthrol. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل خلايا العضلات الملساء المنزعة من عينات المثانة البولية البشرية باستخدام علاج إنزيمي متسلسل من خطوتين.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

فئة

1. تشريح أنسجة DSM وتحضير قطع DSM الخالية من الغشاء المخاطي

1. افحص عينة المثانة البولية ذات السماكة الكاملة التي وصلت إلى المختبر من غرفة العمليات في وعاء محكم الغلق مملوء بمحلول التشريح / الهضم البارد (الشكل 1 والجدول 1 لتكوين DS).
   ملاحظه: عادة ما يتم الاحتفاظ بالعينة في DS البارد من بضع ساعات إلى الليل قبل وصولها إلى المختبر. لتخزين أطول ، يتم استكمال DS (الجدول 1) ب 1 ملي مولار CaCl₂.
2. قم بإزالة وشطف عينة DSM ذات السماكة الكاملة للإنسان (التي تحتوي على جميع الطبقات بما في ذلك الغشاء المخاطي و DSM و serosa) باستخدام DS المثلج لغسل الحطام والدم المرفق.
3. قم بتثبيت عينة المثانة البولية ، الغشاء المخاطي المتجه لأعلى والمصل لأسفل ، على طبق دائري مطلي بالسيليكون (جدول المواد) بقطر 150 مم مملوء ب DS المثلج (الشكل 1 ب).
4. قم بإزالة الأنسجة الدهنية المجاورة والأوعية الدموية والظهارة (الظهارة البولية) والغشاء المخاطي العضلي من العينة عن طريق التشريح الحاد باستخدام المقص الدقيق والملقط.
5. اقطع عدة قطع DSM الخالية من الغشاء المخاطي (~ 2-3 مم وعرض 4-6 مم) (الشكل 1C).

فئة

2. التفكك الأنزيمي لقطع DSM ينتج عنه خلايا DSM مفردة معزولة حديثا

1. ضع 3 إلى 6 قطع DSM في أنبوب يحتوي على 1 إلى 2 مل من DS الدافئ مسبقا (~ 37 درجة مئوية) المحتوي على غراء وديثيوثريتول (DS-P ، الجدول 1) واحتضان قطع DSM في DS-P لمدة 30-45 دقيقة عند ~ 37 درجة مئوية مع رج الأنبوب برفق من حين لآخر (مرة كل 10-15 دقيقة).
   ملاحظه: للتحكم الأمثل في درجة الحرارة للمعالجة الأنزيمية ، يتم وضع الأنابيب التي تحتوي على قطع الأنسجة ومحاليل الإنزيم إما في غرفة أنسجة زجاجية مملوءة بالماء متصل بحمام مائي ساخن متداول (الشكل 1 د) أو حمام مائي اهتزازي عالي الدقة يتم التحكم في درجة حرارته (الشكل 1 ه).
2. قم بإزالة DS-P من الأنبوب ، واغسل قطع DSM لفترة وجيزة باستخدام DS المثلج ، وتخلص من DS البارد من الأنبوب تاركا قطع DSM جالسة في الجزء السفلي من الأنبوب.
3. أضف 1 إلى 2 مل من الكولاجيناز المحتوي على DS من النوع الثاني (DS-C ، الجدول 1) إلى الأنبوب مع قطع DSM ؛ امزج واحتضن برفق لمدة 25-40 دقيقة عند ~ 37 درجة مئوية مع رج الأنبوب برفق من حين لآخر (كل 10-15 دقيقة).
4. تخلص من DS-C واغسل قطع DSM المعالجة بالإنزيم من 5 إلى 10 مرات باستخدام DS المثلج.
5. بعد الغسيل الأخير، اترك محلول DS داخل الأنبوب؛ قم بترتيتوري برفق باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار عدة مرات لتحرير خلايا DSM مفردة.
6. ضع بضع قطرات من محلول DS الذي يحتوي على خلايا DSM مشتتة على حجرة ذات قاع زجاجي أو غطاء وافحصها بصريا تحت المجهر (باستخدام هدف 20x أو 40x) بعد 5 دقائق على الأقل بعد التطبيق للسماح للخلايا بالالتصاق بالقاع.
7. استخدم على الفور خلايا DSM المعزولة حديثا لإجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية أو قم بتخزين الخلايا في أنبوب يحتوي على DS عند ~ 4 درجة مئوية إما على الثلج أو في الثلاجة حتى الاستخدام (عادة لمدة تصل إلى 8 ساعات من التحضير).
   ملاحظه: ضمن نفس المستحضر ، تختلف جودة الخلايا من خلايا DSM شديدة الحيوية إلى خلايا DSM الميتة شديدة الهضم (الشكل 2). عندما تنتج طريقة غراء الكولاجيناز المتسلسلة عددا كبيرا جدا من الخلايا غير القابلة للحياة ، يتم التخلص من المستحضر ، ويتم إجراء عملية هضم جديدة لقطع DSM ولكن مع فترات حضانة أقل. إذا نتج عن الإجراء عدد قليل جدا من خلايا DSM ، فعندئذ من أجل الهضم اللاحق لقطع DSM ، يتم زيادة فترات الحضانة. يؤكد التفاعل المناعي الإيجابي لأكتين العضلات الملساء α هوية خلايا DSM (الشكل 3).

نوع الحل التكوين (بالملليمتر) DS (محلول التشريح / الهضم) 80 Na-glutamate, 55 كلوريد الصوديوم, 6 كيلو كلوريد, 10 هيبلاس, 2 ملغ كلوريد₂, و 11 جلوكوز, الرقم الهيدروجيني معدل إلى 7.4 (مع 10 M هيدروكسيد الصوديوم) DS-P (DS المحتوي على غراء) DS يحتوي على 1-2 مجم / مل غراء ، 1 مجم / مل ثنائي ثيوثريتول و 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار DS-C (DS المحتوي على الكولاجيناز) محلول DS يحتوي على 1-2 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الثاني ، و 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار ، و 0 أو 1 مجم / مل مثبط التربسين و 100-200 ميكرومتر من الكالسيوم²⁺ P (ماصة) 110 CsOH ، 110 حمض الأسبارتيك ، 10 كلوريد الصوديوم ، 1 MgCl2 ، 10 HEPES ، 0.05 EGTA ، و 30 CsCl ، تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع CsOH ، ومكمل بالأمفوتريسين-B (300-500 ميكروغرام / مل) E (خارج الخلية) 10 كلوريد رباعي إيثيل أمونيوم (TEA) ، 6 CsCl ، 124 كلوريد الصوديوم ، 1 ملغ كلوريد_{2 ،} 2 كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 10 هيبيس ، و 10 جلوكوز ، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3-7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم أو CsOH ، و 0.002-3 (2-3 مليمتر) نيفيديبين

الجدول 1: تركيبات محلول التشريح / الهضم (DS) ، والماصة والمحاليل خارج الخلية المستخدمة في تجارب مشبك التصحيح المثقوب.

النتائج

الشكل 1: ملخص خطوات التشريح التي أدت إلى إعداد قطع العضلات الملساء (DSM) والإعداد المستخدم للتفكك الأنزيمي. تظهر صور ل: (أ) عينة من المثانة البولية البشرية بسماكة كاملة يتم توفيرها من جراحة المثانة المفتوحة كمادة جراحية غريبة في DS المثلجة ، (ب) نفس المستحضر بعد التثبيت بطبقة DSM مقطوعة جزئيا ، (ج) قطع DSM ذات أبعاد متغيرة مقطوعة من ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5 مل من البوليسترين أنبوب دائري القاع صقر 352054 أنابيب ل DS تحتوي على إنزيمات تستخدم في خطوات الهضم خلاط دوامة تناظرية VWR 58816-121 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 7906 د. كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش سي 1016 حل خارج الخلية و DS EGTA سيجما ألدريتش E3889 مخلب Ca2 + ، يستخدم في محلول الماصة داخل الخلايا الجلوكوز سيغما G8270 نوع الكولاجيناز 2 شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LS004177 DS-C هيدرات هيدروكسيد السيزيوم سيجما ألدريتش ج8518 محلول الماصة داخل الخلايا سي إس إل سيجما ألدريتش 203025 المحاليل خارج الخلية وداخل الخلايا DL-Dithiothreitol (DDT) سيجما ألدريتش د9779 عوامل الاختزال المستخدمة مع غراء هيدروكسيد الصوديوميوم سيجما ألدريتش إس 8045 نيفيديبين سيجما ألدريتش N7634 مانع قناة Ca2 + من النوع L رف / حامل أنبوب رغوة عائمة VWR العلمية 82017-634 تستخدم لعقد الأنابيب مع الإنزيمات للتحكم في درجة الحرارة حمض الجلوتاميك (ملح Na) سيجما ألدريتش [غ1626] د. غراء شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LS003126 DS-P MgCl2 (سداسي هيدرات) سيجما ألدريتش M2670 المحاليل خارج الخلية وداخل الخلايا كيه سي إل فيشر ساينتيك ص366-1 محلول خارج الخلية كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 المحاليل خارج الخلية وداخل الخلايا إبرة حقنة غير معدنية ، MicroFil WPI MF-34G-5 تعبئة محلول الماصة داخل الخلايا ماصة باستور فيشر براند 13-678-20 أ يتم قطع الأطراف وصقلها بالنار واستخدامها لمعايرة الأنسجة المعالجة إنزيميا لتحرير خلايا DSM مفردة من القطع هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 عازلة الأس الهيدروجيني حمام مائي يهتز الدقة الحرارية العلمية (موديل 2870) الترمو: العلمية توقف حمام مائي للتحكم في درجة حرارة الهضم الأنزيمي المستخدم كبديل لإعداد حمام غرفة الأنسجة أنابيب الفينيل كول بالمر 06405-3 استخدامات متعددة بما في ذلك لتوصيل حمام الأنسجة بالحمام المائي المتداول حمام تدوير المياه, Haake D1 L هاك توقف متصل بحمام المناديل مجهر مقلوب ZeissAxiovert 40C بأهداف 10x و 40x كارل زايس توقف جزء من إعداد جهاز التصحيح