تحليل المشبك المثقوب بوساطة الأمفوتريسين-B: تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لدراسة التيارات الأيونية في خلايا المثانة البولية

Abstract

المصدر: Malysz، J. et al. تحضير واستخدام خلايا العضلات الملساء البشرية المعزولة حديثا لتوصيف التيارات الكاتيونية الحساسة ل 9-phenanthrol. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو توصيف التيارات الموجبة من القنوات الأيونية المحتملة للمستقبلات العابرة من النوع 4 (TRPM4) في خلايا العضلات الملساء المكسومة باستخدام تقنية مشبك التصحيح المثقوب بوساطة الأمفوتريسين-B. تساعد هذه التقنية في تقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية والدوائية للقنوات الأيونية.

Protocol

< p class = "jove_title" style = "margin-left: 0.25in ؛ ">1. تسجيل التيارات الكاتيونية المستحثة بخطوة الجهد من خلايا DSM باستخدام تقنية مشبك تصحيح الجهد المثقب للخلية الكاملة الأمفوتريسين-B

1. ماصة 0.25-1 مل من تعليق الخلية على حجرة ذات قاع زجاجي تجلس على مرحلة من المجهر المقلوب وتسمح للخلايا بالالتصاق بقاع الزجاج.
2. بعد الحضانة لمدة 45 دقيقة على الأقل ، قم بإزالة محلول الهضم (DS) من الحمام واستبدله بمحلول E (الجدول 1) عن طريق الصهار الفائق حيث يستبدل تدفق المحلول بمساعدة الجاذبية عبر أنبوب المدخل DS ببطء بالمحلول الجديد بينما يزيل أنبوب المخرج المتصل بوعاء نفايات مفرغ محلول الغرفة ويمنع الفائض.
   ملاحظه: يحتوي محلول E على أيونات رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA ⁺) والسيزيوم (Cs ⁺) لتثبيط تيارات K ⁺.
3. تحضير محلول مخزون عامل من الأمفوتريسين-ب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (1 مجم لكل 10 ميكرولتر من DMSO). لإذابة مسحوق الأمفوتريسين بالكامل ، سونيكات (15 دقيقة على الأقل) ودوامة المحلول جيدا.
   ملاحظه: تستغرق هذه الخطوة عادة أقل من 10 دقائق. يعمل إذابة 3-4 مجم من الأمفوتريسين-ب في 30-40 ميكرولتر من DSMO في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل بشكل جيد. تتطلب الكميات الأعلى من الأمفوتريسين-B مزيدا من مذيب DSMO مما يؤدي عادة إلى فترة زمنية أطول للخلط والذوبان غير الكامل للجزيئات الصلبة الأمفوتريسين-B الموجودة في الأنبوب.
4. قم بإذابة محلول مخزون الأمفوتريسين-B في محلول الماصة (المحلول P، الجدول 1) للحصول على تركيز نهائي يتراوح بين 200 و500 ميكروغرام/مل. تتطلب هذه الخطوة صوتنة ودوامة واسعة النطاق في إعداد عالي السرعة (8-10/10) لمدة ~ 30 إلى 60 دقيقة لكل خطوة لضمان الخلط الأمثل ومنع تكوين الرواسب الأمفوتريسين-B في محلول الماصة.
   ملاحظه: سوف يترسب الأمفوتريسين-ب بمرور الوقت وهو حساس للضوء. يتم فحص محلول الماصة العامل الذي يحتوي على Amphotericin-B للتأكد من قابليته للذوبان، وخلطه يدويا قبل ملء الماصة، وحفظه في الظلام.
5. اسحب أقطاب كهربائية متعددة ، وأطراف قطب تلميع للحريق ، و (إذا لزم الأمر) قم بتغطية الأطراف بشمع الأسنان.
6. املأ طرف قطب الرقعة بمحلول الماصة (المحلول P، الجدول 1) بدون أمفوتريسين-B عن طريق غمس القطب الكهربائي لفترة وجيزة في المحلول.
7. قم بإعادة ملء القطب بنفس محلول الماصة الذي يحتوي على الأمفوتريسين-B.
8. قم بتركيب القطب الكهربائي على حامل متصل بمنصة رأس مضخم التصحيح المشبب.
9. باستخدام معالج دقيق ، ضع القطب الكهربائي أسفل سطح المحلول خارج الخلية مباشرة بحيث يتم غمر طرف القطب الكهربائي.
10. في وضع مشبك الجهد الكهربائي، اضبط إمكانات التثبيت على 0 مللي فولت واضبط التيار على 0 بيكسل أمبير باستخدام قرص إزاحة الماصة على مكبر الصوت التجاري (جدول المواد).
11. تحديد مقاومة القطب الكهربائي باستخدام نافذة / وظيفة اختبار الغشاء لبرنامج الاستحواذ التجاري (جدول المواد). للتنشيط، انقر فوق أدوات>اختبار الغشاء>تشغيل أو أيقونة اختصار في البرنامج. يجب أن تكون مقاومة القطب المحدد في حدود 2 إلى 5 MΩ.
    ملاحظه: يمكن استخدام وظيفة اختبار الغشاء المتوفرة في برنامج الاستحواذ التجاري أو خيار اختبار الختم على مكبر الصوت لمراقبة مقاومة القطب الكهربائي عن طريق تطبيق خطوات الجهد بشكل متكرر.
12. استمر في مراقبة مقاومة القطب الكهربائي أثناء دفع القطب نحو خلية DSM المختارة باستخدام معالج دقيق (الشكل 1 أ).
    ملاحظه: لكي يتم اعتبارها خلية DSM قابلة للحياة ، يجب أن تظهر الخلية مورفولوجيا ممدودة على شكل مغزل ، وهالة محددة جيدا حول الخلية ، وحواف واضحة ، ومظهر شبه مقلص (أفعوني).
13. عند لمس سطح الخلية بالقطب الكهربائي - المشار إليه بزيادة سريعة في مقاومة القطب المقاس بوظيفة اختبار الغشاء - قم بتشكيل ختم جيجا عن طريق تطبيق ضغط سلبي سريع لطيف على حامل القطب الكهربائي عبر الأنابيب. ينتج عن هذا ضغط سلبي ينشأ عند طرف القطب الذي يسحب غشاء الخلية إلى قطب كهربائي مما يساعد في تكوين ختم جيجا أو اتصال محكم جدا بين القطب الكهربائي وغشاء البلازما (الشكل 1 ب).
14. بمجرد تشكيل مانع التسرب الجيجا، قم بتعويض سعة الماصة عن طريق ضبط الأقراص السريعة والبطيئة على مكبر الصوت التجاري ومراقبة ثبات مانع التسرب الجيجا (تيار التسرب) باستخدام وظيفة اختبار الغشاء.
15. اترك الوقت ، عادة 30-60 دقيقة ، حتى ينتشر الأمفوتريسين-B أسفل الماصة ويتم إدخاله في غشاء البلازما لتشكيل مسام انتقائية بشكل أساسي للكاتيونات أحادية التكافؤ. خلال هذه الخطوة ، استمر في مراقبة ختم الجيجا باستخدام وظيفة اختبار الغشاء. مع زيادة ثقب الخلية ، يزداد سعة عابرات السعة (قارن الشكل 1 ب مقابل الشكل 1 ج الذي لا يظهر أي ثقب خلية فعال ، على التوالي) تم قياسه باستخدام وظيفة اختبار الغشاء.
16. عندما يكون ثقب التصحيح هو الأمثل (يتم الحكم عليه من خلال مقاومة السلسلة المستقرة عادة أقل من 50 MΩ) ، قم بإلغاء عابرات السعة عن طريق ضبط الأقراص لسعة الخلية ومقاومة السلسلة على مكبر الصوت. يمكن أيضا إجراء تعويض المقاومة المتسلسلة في هذا الوقت (الشكل 1 د).
17. بمجرد ملاحظة التيارات الكاتيونية المستحثة بجهد مستقرة التي يثيرها البروتوكول المحدد ، قم بتطبيق حالة مركب أو فسيولوجية للاختبار عن طريق الصهر الفائق وتسجيل الاستجابات للتحكم وحالة الاختبار والغسيل (إن أمكن) باستخدام برنامج الاستحواذ التجاري.
    1. سجل التيارات باستخدام بروتوكول خطوة الجهد الروتيني الذي يتضمن الاحتفاظ بخلايا DSM عند -64 أو -74 مللي فولت وزيادة الجهد بزيادات قدرها 10 مللي فولت لمدة 400 أو 500 مللي ثانية من -94 إلى +96 أو +106 مللي فولت والعودة إلى إمكانات الاحتجاز.
       ملاحظه: يتم ضبط قيم جهد الغشاء لجهد تقاطع سائل يبلغ 14 مللي فولت (باستخدام محاليل P و E ، الجدول 1). يتم الحصول على إمكانات الوصلة السائلة في برنامج الاستحواذ التجاري (جدول المواد) بالنقر فوق Tools>Junction Potentials وإدخال تركيزات مكونات أيون المحلول. يمكن أيضا استخدام بروتوكول المنحدر للحصول على التسجيلات الحالية.
    2. قم بتشغيل بروتوكول الجهد في فاصل زمني مستمر ~ 1 دقيقة أثناء تجربة تسجيل التيارات للتحكم في الإضافة المسبقة وحالة الاختبار والغسيل

نوع الحل التكوين (بالملليمتر) DS (محلول التشريح / الهضم) 80 Na-glutamate, 55 كلوريد الصوديوم, 6 كيلو كلوريد, 10 هيبلاس, 2 ملغ كلوريد₂, و 11 جلوكوز, الرقم الهيدروجيني معدل إلى 7.4 (مع 10 M هيدروكسيد الصوديوم) DS-P (DS المحتوي على غراء) DS يحتوي على 1-2 مجم / مل غراء ، 1 مجم / مل ثنائي ثيوثريتول و 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار DS-C (DS المحتوي على الكولاجيناز) محلول DS يحتوي على 1-2 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الثاني ، و 1 مجم / مل من زلالات الدم البقري ، و 0 أو 1 مجم / مل مثبط التربسين و 100-200 ميكرومولار من الكالسيوم²⁺ P (ماصة) 110 CsOH ، 110 حمض الأسبارتيك ، 10 كلوريد الصوديوم ، 1 MgCl₂ ، 10 HEPES ، 0.05 EGTA ، و 30 CsCl ، تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع CsOH ، ومكمل بالأمفوتريسين-B (300-500 ميكروغرام / مل) E (خارج الخلية) 10 كلوريد رباعي إيثيل أمونيوم (TEA) ، 6 CsCl ، 124 كلوريد الصوديوم ، 1 ملجمكلوريد_{الصوديوم 2} ، 2 كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 10 هيبيس ، و 10 جلوكوز ، معدل الرقم الهيدروجيني إلى 7.3-7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم أو CsOH ، و 0.002-3 (2-3 مليمتر) نيفيديبين

الجدول 1: تركيبات محلول التشريح / الهضم (DS) ، والماصة والمحاليل خارج الخلية المستخدمة في تجارب مشبك التصحيح المثقوب.

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: رسم تخطيطي للخطوات المتضمنة في تكوين ختم جيجا وثقب الأمفوتريسين-ب لخلايا DSM البشرية. يتضح من المواضع المكانية لماصة تحتوي على أمفوتريسين-B وخلية DSM جنبا إلى جنب مع الاستجابات المرتبطة باختبارات الغشاء التي تم الحصول عليها في برنامج الاستحواذ التجاري (جدول المواد) عن طريق تغيير خطوات الجهد (إما -10 أو -20 مللي فولت في هذا المثال) لتحديد المقاومة....

Materials