تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم التضحية بالفئران غير المعالجة والصحية من النوع البري (WT) (ن = 4) و
cd44 - / - (ن = 4) في سن 12-16 أسبوعا. تم استخدام كل من الفئران من الذكور والإناث كانت جميع الفئران على خلفية C57Bl / 6.
< p class = "jove_title" >
1. تشريح الكلى الفأر
- التضحية بالفئران السليمة WT أو الفئران المعدلة وراثيا عن طريق خلع عنق الرحم.
- تشريح كلي الفئران الكاملة مباشرة بعد التضحية بالفئران. لهذا ، قم بإجراء شق البطن المتوسط باستخدام مقص البطن ، وقطع الجلد ثم عضلات البطن. قم بإزالة الأمعاء وضعها بجانب الماوس.
- حرر الكلى من الأنسجة المتصلة واسحب الكلى باستخدام ملقط جراحي ، وقطع الشريان الكلوي والوريد الكلوي والحالب بالمقص.
- قم بإزالة الكبسولات الكلوية من الكلى عن طريق إمساك الكلى بالملقط الجراحي واسحب الكبسولة باستخدام زوج آخر من الملقط.
- ضع الكلى في صفيحة زراعة خلايا مكونة من 6 آبار (2 كليتان / بئر) محضرة ب 2 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) لكل بئر وضعها على الثلج.
< p class = "jove_title" >
2. عزل الكبيبات من كلية الفأر
- انقل الكلى إلى طبق بتري مقاس 100 مم وافرم الكلى إلى قطع صغيرة من 1-2 مم باستخدام مشرطين. حافظ على قطع الكلى المفرومة مبللة باستخدام 1-2 مل من HBSS.
- ضع قطع الكلى المفرومة فوق منخل معدني 300 ميكرومتر واضغط على الكلية من خلال المنخل باستخدام مكبس من حقنة سعة 20 مل. اشطف المنخل بشكل متكرر مع HBSS بينهما واجمع التدفق في طبق بتري نظيف باستخدام ماصة مصلية. جمع أيضا كل ما تبقى / يلتصق إلى الجانب السفلي من الغربال عن طريق كشطه باتجاه آخر مع المشرط ونقله إلى التدفق المجمع من خلال (كلية متجانسة).
- اشطف الكلى متجانسة من خلال غربال 75 ميكرومتر باستخدام HBSS. اجمع التدفق ثم اشطف هذا التدفق من خلال غربال 53 ميكرومتر. اغسل كلا المناخلين باستخدام HBSS لإزالة جميع الهياكل الأصغر.
ملاحظه: في هذه الخطوة ، يتم شطف التدفق فقط ولكن لا يتم الضغط عليه من خلال غربال 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر. الغسيل باستخدام HBSS ضروري لإزالة الحطام والهياكل الأصغر على المناخل. لذلك ، عادة ما يتم استخدام 200-300 مل من HBSS في المجموع.
- اجمع هياكل / مواد الكلى التي تبقى على غربال 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر عن طريق غسل السطح العلوي للغربال باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 20٪ (FCS) ونقل المادة إلى صفيحة دقيقة مرفقة بسعة 6 آبار.
ملاحظه: لغسل السطح العلوي للغربال ، اشطف المنخل في وضع مائل (>45 درجة) واجمع مادة الكلى على حافة المنخل. يتم إثراء المواد التي تم جمعها من أجل الكبيبات المغلفة وغير المغلفة ، ولا تظهر سوى عدد قليل من الأجزاء الأنبوبية. الكبيبات المغلفة لزجة جدا. لجمع الكبيبات المفردة ، من المهم منع الكبيبات من الالتصاق بسطح طبق بتري أو صفيحة البئر. لتجنب الالتصاق ، استخدم وسيطا يحتوي على 20٪ FCS واستخدم لوحات تثبيت منخفضة للغاية لهذه الخطوة.
< p class = "jove_title" >
3. استزراع النمو الكبيبي
- قم بإحضار الصفيحة الدقيقة ذات التركيب المنخفض للغاية إلى مجهر ضوئي مقلوب واجمع الكبيبات المغلفة و/أو غير المغلفة باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر. تجنب سحب الهياكل والحطام الأخرى. بعد جمع كبيبة واحدة في طرف الماصة، أضف وسط DMEM جديد بدون مواد كلوية مجمعة في نفس طرف الماصة بحجم 20 ميكرولتر.
- انقل الكبيبة المفردة مع وسط DMEM سعة 20 ميكرولتر إلى مركز بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا واحتضانها لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون2 للسماح بربط الكبيبة بمركز البئر. حرك اللوحة بعناية لتجنب تعويم الكبيبة على حدود البئر.
- بعد 3 ساعات من الحضانة ، يتم ربط الكبيبة بمركز البئر. أضف بعناية 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي البطاني (EBM) مع مجموعة عوامل النمو التي تحتوي على الهيدروكورتيزون ، وعامل النمو البطاني البشري ، ومستخلص الدماغ البقري ، وكبريتات الجنتاميسين - الأمفوتريسين B (جدول المواد) و 5٪ إضافية (v / v) FBS و 1٪ (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (القلم / البكتيريا) لكل بئر.
- استزراع الكبيبات المفردة لمدة 6 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظة: في غضون 6 أيام ، يتم تشكيل النمو الذي يتكون من الخلايا الظهارية الجدارية. إذا كان المرء يهدف إلى اختبار تأثيرات مركبات أو أدوية معينة على الخلايا الظهارية الجداري ، فيجب إضافتها إلى الوسط خلال فترة 6 أيام هذه.
