تحضير الكتل الكروية السرطانية بالتجميد السريع: إجراء للحفاظ على الكتل الكروية السرطانية في كتل المصفوفة المجمدة

الملخص

المصدر: Wang، Y. et al. 3-D نظام زراعة الخلايا لدراسة الغزو وتقييم العلاجات في سرطان المثانة. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير الكتل الكروية السرطانية عن طريق التجميد السريع ، وهي تقنية يتم فيها تجميد عينة من الأنسجة ذات الأهمية إلى درجة حرارة شديدة البرودة ، مما يؤدي إلى تقييد الكتل الكروية داخل المصفوفة.

البروتوكول

فئة

1. تحضير كتلة عينة تحتوي على كرويات سرطانية لتقطيع الأنسجة المجمدة

1. ارفع كتلة جل الكولاجين والكرويات بعناية من شرائح الغرفة باستخدام ملقط صغير. ضع كتلة جل الكولاجين في قالب أنسجة بلاستيكي.
2. اشطف جل الكولاجين باستخدام 1x PBS لفترة وجيزة ثم ثبته بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: PFA مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل معها بحذر.
3. اغسل جل الكولاجين ب 1.5 مل من 1x PBS على شاكر لمدة 15 دقيقة.
4. ضع طبقة رقيقة (حوالي 3 مم) من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لتغطية الجزء السفلي من قالب الأنسجة البلاستيكي الجديد. ضع جل الكولاجين الثابت والمغسول فوق مركب OCT ، ثم قم بتضمين الجل بالكامل بعناية عن طريق ملء القالب بمركب OCT مع تجنب تكوين أي فقاعات هواء في OCT.
5. اترك القالب عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
6. ضع القالب الذي يحتوي على العينة ومركب OCT على طبق بتري مقاس 100 مم يطفو على النيتروجين السائل. اسمح للعينة بالتجميد تماما.
7. قم بتخزين كتلة العينة المجمدة عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسط زراعة الخلايا DMEM ثيرمو فيشر العلمي 11995065 مصل الأبقار الجنينية ثيرمو فيشر العلمي 26140079 مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) ثيرمو فيشر العلمي 15240062 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 3803 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ،
الرقم الهيدروجيني 7.4 ثيرمو فيشر العلمي 10010023 الكولاجين من النوع 1 من ذيل الفئران ، مرتفع
تركيز كورنينج 354249 Nunc Lab-Tek II Chambered
غطاء زجاجي ثيرمو فيشر العلمي 155382 محلول بارافورمالدهايد علوم المجهر الإلكتروني 15710 [م] مركب O.C.T ثيرمو فيشر العلمي 23730571