توصيل بلازميدات الحمض النووي إلى بوليثيليوم مثانة الفأر: إجراء قائم على التثقيب الكهربائي لتوصيل بلازميدات الحمض النووي بكفاءة إلى خلايا الظهارة البولية في مثانة الفئران لتوليد نماذج معدلة وراثيا

الملخص

المصدر: Chuan ، Y. et al. طريقة جديدة لتوصيل الحمض النووي البلازميد إلى بوليثيل مثانة الفأر عن طريق التثقيب الكهربائي. J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو توصيل بلازميد الحمض النووي إلى بولثريوم مثانة الفأر باستخدام مزيج من تقنيات قسطرة مجرى البول والتثقيب الكهربائي. يسمح الإجراء الموصوف بتوليد نماذج سرطان المثانة الفئرانية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير البلازميد والأدوات

1. لكل مثانة يتم نقلها ، قم بإعداد 20 ميكرولتر على الأقل من بلازميد الحمض النووي (1 ميكروغرام / ميكرولتر).
2. أضف 1 ميكرولتر من Trypan Blue إلى 20 ميكرولتر من محلول البلازميد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. الماصة لخلط جيدا.
3. قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. رش الأدوات الجراحية والقفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول بشكل متكرر أو استخدم معقم الخرز الزجاجي عند تنفيذ الخطوات التالية للحفاظ على الظروف المعقمة.

2. تسليم البلازميد

1. ضع 70٪ إيثانول على بطن الفأر المخدر واستخدم مشرطا لعمل شق رأسي بطول 1 سم لفتح جلد البطن فوق المثانة.
2. ماصة ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من البلازميد بالإضافة إلى محلول التربان الأزرق في الطرف الخارجي للقسطرة وإرفاق المحقنة.
3. حقن محلول البلازميد في المثانة. إذا تحولت المثانة إلى اللون الأزرق ، يكون الحقن ناجحا. اترك بعض السوائل في القسطرة لتجنب تكوين فقاعات هواء في المثانة.
4. أمسك فتحة مجرى البول الخارجية باستخدام الملقط ثم قم بإزالة القسطرة والحقنة. استخدم خيطا لشد فتحة مجرى البول الخارجية. اصنع حلقتين بالخيط ثم اربطه بعقدتين.
   ملاحظه: شد مجرى البول مهم لمنع ارتجاع سائل البلازميد.
5. قم بتشغيل مولد التثقيب الكهربائي باستخدام المعلمات التالية: 33 فولت ، 50 مللي ثانية وقت العمل ، و 950 مللي ثانية من الفاصل الزمني.
6. أمسك المثانة بالملاقط واقرص المثانة بقطبين. ادفع دواسة القدم لإجراء التثقيب الكهربائي.
   ملاحظه: يتم ضبط النبضات الكهربائية لتحدث 5 مرات بفترات قصيرة بعد كل ضغطة دواسة. قد يرتعش الفأر في هذه العملية. يمكن أن يؤدي دفع دواسة القدم أكثر من مرة إلى زيادة كفاءة التوصيل ، ولكن الكثير من النبضات الكهربائية يمكن أن تلحق الضرر بسلامة أنسجة الظهارة البولية.
   1. تجنب أي اتصال بين الملقط والأقطاب الكهربائية ، لأن ذلك سيولد شرارة.

3. الانتعاش

1. خياطة فتحة البطن والجلد بخيوط ومشابك جراحية معقمة. ضع اليود على الجرح.
2. قم بإزالة من نظام الأيزوفلوران. تطبيق مسكن البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
3. احتفظ بالحيوان على وسادة التدفئة وأعده إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام. افحص مرة واحدة على الأقل يوميا بحثا عن سلوكيات الحركة والشرب والتغذية الطبيعية وعدم وجود علامات للعدوى حتى يلتئم الشق ، ثم قم بإزالة المشابك. قم بإعطاء الحقن اللاحقة من مسكن البوبرينورفين إذا ظهرت على أعراض الألم مثل انخفاض الاستمالة وزيادة العدوانية والنطق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حقنة 1 مل من الدينار بحريني صياد هاتف: 148232ه بوبرينورفين سيغما ب 9275-50 ملغ ملاقط دومون روبوز الجراحية RS-5005 علاج مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام الجراحي ECM830 SQ موجة كهربائية جهاز هارفارد 450052 قسطرة Exel International Safelet IV التي يمكن التخلص منها فيشر ساينتيك 14-841-21 24 جم ، طول 2.11 سم ، قطر خارجي 0.045 سم مقص تشريح دقيق فائق الدقة روبوز الجراحية RS-5135 علاج مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام الجراحي إيزوفلوران طبيب بيطري واحد 501017 K&H سجادة استراحة ساخنة للحيوانات الصغيرة ، 9 × 12 بوصة الامازون قم بتغطية حصيرة الحرارة بمناشف ورقية مرهم العيون صياد NC0849514 برنامج تلفزيوني ، درجة الحموضة 7.4 تقنيات الحياة 10010049 أطراف الماصة 200 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-0206 أطراف الماصات، مقاس عالمي؛ 0.1 إلى 10 ميكرولتر صياد 02707438 (CS) بيبيتمان نيو P2 جيلسون F144561 بيبيتمان نيو P200N جيلسون F144565 البلازميد CAG-GFP أدجين 16664 البلاتين تويزرترود 5 مم جهاز هارفارد 450489 قطر 5 مم مقص روبوز الجراحية RS-5880 علاج مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام الجراحي سلسلة الحبل الامازون ماندالا الحرف 150D 210D 0.8 مم 1 مم خياطة جلدية خياطة مسطحة مشمع خيط سلسلة الحبل شريط لاصق ، سكوتش صياد 19047257 ثيريو جل زيوت التشحيم البيطرية PBS صحة 353-736 تريبان بلو ستين تقنيات الحياة 15250061 V-1 تخدير نظام سطح الطاولة فيكيب 901806 خياطة فيكريل البنفسجي 18 "FS-2 قطع 5-0 صياد NC0578475 Walgreens بوفيدون اليود 10٪ والجرينز 953982 مشبك الجرح صياد 18045 تطبيق مشبك الجرح صياد 1804