مقالة منهجية

عزل الإكسوزوم: تقنية طرد مركزي فائق تعتمد على الكثافة باستخدام وسادة السكروز لفصل الإكسوسومات عن الوسائط المكيفة للخلايا المستزرعة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Faruqu ، F. N. et al. تحضير الإكسوسومات لتوصيل siRNA إلى الخلايا السرطانية.J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية طرد مركزي فائق قائم على الكثافة لعزل الإكسوسومات من الوسائط المكيفة التي يتم حصادها من مزارع خلايا الكلى الجنينية البشرية باستخدام وسادة سكروز بنسبة 25٪ (وزن / وزن) محضرة في أكسيد الديوتيريوم. يمكن استخدام الإكسوسومات المعزولة للتطبيقات النهائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل Exosome على وسادة السكروز

  1. قم بتنظيف الوسائط المكيفة المحصودة مسبقا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي والترشيح على النحو التالي.
    1. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. كرر خطوة الطرد المركزي هذه مرة أخرى ، واسترجع المادة الطافية وتخلص من الحبيبات.
    2. جهاز الطرد المركزي للطافي من الخطوة 1.1. عند 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة و 4 درجات مئوية ثم تخلص من الحبيبات. قم بتصفية المادة الطافية المستردة مرة واحدة من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر.
  2. أثناء المقاصة المسبقة ، قم بإعداد محلول السكروز بنسبة 25٪ (وزن / وزن) في أكسيد الديوتيريوم عن طريق وزن 1.9 جم (± 0.001 جم) من السكروز بدقة في أنبوب عالمي ، ثم قم بتغطيتها بأكسيد الديوتيريوم حتى يصل الوزن إلى 7.6 جم (± 0.001 جم).
  3. املأ أنبوب الطرد المركزي الفائق (انظر جدول المواد) ب 22.5 مل من CM الذي تم تطهيره مسبقا. قم بتكوين CM إلى 22.5 مل باستخدام PBS مفلتر 0.22 ميكرومتر إذا كان الحجم الحالي أقل من ذلك.
  4. ضع ماصة زجاجية (انظر جدول المواد) في الأنبوب ، ومن خلالها ، أضف 3 مل من محلول السكروز بحيث يشكل المحلول طبقة منفصلة أسفل CM.
  5. ضع الأنبوب الذي يحتوي على محلول CM / سكروز ذو طبقات بعناية في دلو الدوار المتأرجح للخارج (انظر جدول المواد) وقم بتأمين الجرافة في الدوار.
  6. ضع الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق (انظر جدول المواد) وقم بالدوران عند 100,000 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  7. اجمع 2 مل من طبقة السكروز وأضفها إلى زجاجة أجهزة الطرد المركزي الفائقة (انظر جدول المواد) التي تحتوي على 20 مل من PBS المصفى لخطوة الغسيل.
  8. ضع الأنابيب في دوار بزاوية ثابتة (انظر جدول المواد) وقم بالدوران عند 100,000 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل وأعد تعليق الحبيبات باستخدام 400 ميكرولتر من PBS مفلتر. احتفظ بمخزون الإكسوسوم هذا عند 4 درجات مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين قصير الأجل وطويل الأجل على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سكروز فيشر ساينتيك S/8600/60 1 كجم أكسيد الديوتيريوم (D2O) سيجما ألدريتش 151882 250 جرام 1X محلول ملحي مخزن الفوسفات ثيرمو فيشر العلمي 10010015 500 مل وحدة تصفية حقنة Millex-GP 0.22 ميكرومتر ميليبور SLGP033RS جهاز طرد مركزي فائق بيكمان كولتر أوبتيما XPN-80 دوار متأرجح للخارج بيكمان كولتر SW45 تي دوار بزاوية ثابتة بيكمان كولتر اكتب 70 Ti أنابيب الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر 355631 البولي كربونات. التعبئة القصوى 32 مل زجاجات الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر 355618 البولي كربونات. الحد الأدنى للتعبئة 16 مل ، الحد الأقصى للتعبئة 25 مل الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص الماصات الزجاجية فيشر ساينتيك 1156-6963 25٪ وزن / وزن وسادة السكروز أضف 1.9 جم (± 0.001 جم) من السكروز في أنبوب عالمي ، وقم بتعبئتها ب D2O حتى يصل الوزن إلى 7.6 جم (± 0.001 جم). هذا يجعل ~ 6 مل من 25٪ وزن / وزن وسادة السكروز.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Exosome IsolationUltracentrifugation TechniqueSucrose CushionConditioned MediaDensity GradientExosome PurificationCell Culture SupernatantHigh Speed CentrifugationSucrose SolutionPBS Washing

مقالات ذات صلة