تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. معالجة الأنسجة وعزل الخلايا الأنبوبية الأولية
- قم بإزالة كبسولات الكلى والنخاع ، وفرم كلتا الكليتين إلى قطع صغيرة ، واحتضانها في 10 مل من عازلة الهضم في فرن 37 درجة مئوية مع دوران لطيف لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة أي أنسجة كلوية غير مهضومة عن طريق تمرير المخزن المؤقت عبر مرشح 70 ميكرومتر. أضف 10 مل من وسائط الثقافة لوقف الهضم.
- لجمع الخلايا الأنبوبية ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المفلترة عند 50 × جم لمدة 5 دقائق لجمع الحبيبات الأولى. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وأضف 5 مل من وسائط الاستزراع ، وقم بطردها عند 50 × جم لمدة 5 دقائق لضمان جمع جميع الخلايا الأنبوبية في الحبيبات الثانية. يكون الطرد المركزي بسرعة أقل لبيليه الأنابيب الثقيلة في المقام الأول. في وقت لاحق ، بعد أن تتعافى الخلايا من العزلة ، يتم الطرد المركزي للثقافة الأنبوبية النقية بسرعة أعلى أثناء الثقافات الفرعية.
- أعد تعليق الحبيبات الأولى في 20 مل من وسائط الاستزراع وقم بطردها عند 50 × جم لمدة 5 دقائق لجمع الحبيبات الثالثة.
- أعد تعليق الكريات الثانية والثالثة في 1 مل من وسائط الاستزراع. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من Trypan Blue ، وقم بتحميل الخليط في الغرفة A لشريحة العد ، وسجل صلاحية الخلية من عداد الخلية التلقائي.
- قم بزرع ما يصل إلى 107 خلايا (مجموعة غير متجانسة) في طبق واحد بحجم 60 مم مغطى مسبقا بالكولاجين واترك الخلايا الأنبوبية تلتصق طوال الليل.
