تلطيخ الحمض الدوري أو PAS: طريقة لتقييم التشوهات الهيكلية للكبيبات

الملخص

المصدر: Stevens، M.، Oltean، S. تقييم وظائف الكلى في نماذج الفئران لمرض الكبيبات.J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكول إجراء صبغة Schiff الحمضية الدورية (PAS) لتقييم التشوهات الهيكلية في كبيبات الكلى. تتيح طريقة تلطيخ PAS التقييم المناسب للفيزيولوجيا المرضية للكبيبات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. صبغة الحمض الدورية (PAS)

ملاحظة: ستسلط صبغة PAS الضوء على الأغشية القاعدية للحلقات الشعرية الكبيبية والظهارة الأنبوبية. إنه يتيح التصور التفصيلي للخلايا الكبيبية ، والمصفوفة المتوسطة والتوسع المحتمل ، والتغيرات المحتملة ل GBM (أي السماكة والمخالفات).

1. قم بتقسيم قشرة الكلى المثبتة بالبارافين باستخدام ميكروتوم بسمك 5 ميكرومتر على شرائح مطلية ب poly-L-lysine. يجف عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تأكد من أن القسم لا يحتوي على أي طيات أو ثقوب ، والتي يمكن أن تشوه التشكل تحت المجهر.
2. قم بإزالة الشرائح عن طريق احتضانها مرتين في الزيلين (تحذير ، مهيج ؛ استخدم في خزانة الدخان) لمدة 3 دقائق لكل منهما ، مرتين في 100٪ EtOH لمدة 3 دقائق لكل منهما ، ثم مرة واحدة في 95٪ و 70٪ و 50٪ EtOH لمدة 3 دقائق لكل منهما ، كل ذلك في درجة حرارة الغرفة. أعد ترطيب الشرائح في dH₂O.
3. احتضان الشرائح في محلول حمضي دوري (تحذير ، مهيج ؛ استخدم في خزانة الدخان) (1 جم / ديسيلتر) لمدة 5 دقائق ، ثم اشطف الشرائح بعدة تغييرات من dH₂O. استخدم وعاءا يحتوي على 100 مل dH₂O في درجة حرارة الغرفة.
4. احتضان الشرائح في كاشف شيف (باراسونيلين حمض الهيدروكلوريك 6 جم / لتر وميتابيسلفيت الصوديوم 4٪ في حمض الهيدروكلوريك 0.25 مول / لتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق.
5. مضاد البقع باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 3 ثوان قبل شطف الشرائح جيدا في ماء الصنبور الجاري لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظه: قد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسينات لتحديد الوقت الأمثل لتلوين الهيماتوكسيلين.
6. تجفيف الشرائح باستخدام عكس بروتوكول إزالة البارافين. ننتهي بالزيلين.
7. ينزلق بالهواء ويركب بوسائط تركيب قائمة على الزيلين.
8. صورة على مجهر ضوئي بتكبير 400X لتقييم الهياكل الكبيبية. قم بتقييم ما يلي: سماكة ومخالفات GBM ، وانهيار الحلقات الشعرية ، والأنسجة الليفية ، والتصلب ، والتكاثر الخلوي (البطانية ، والخلايا البودية ، والخلايا المتوسطة ، أو الخلايا الالتهابية التي تتسلل إلى الخصل).
   ملاحظه: لإجراء تقييم شامل للفيزيولوجيا المرضية الكبيبية ، يجب تقييم الآفات في أماكن أخرى من الكلى ، كما هو الحال في الأنابيب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام تلطيخ الأحماض الدورية (PAS) سيجما ألدريتش 395 ب -1 كيلو طن الهيماتوكسيلين سيجما ألدريتش إتش 3136 الزيلين ميرك ميليبور 108298 شرائح بولي الإعدادية سيجما ألدريتش P0425-72EA تصاعد متوسط ثيرموفيشر العلمي 8030 قلم مسعور أبكام أب 2601 مضحك ضوء الفلورسنت لايكا مايكروسيستمز برنامج تحليل الصورة J الصورة J