حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي: تقنية لتوصيل الحمض النووي مباشرة إلى خلايا الكلى في نموذج الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Woodard ، L. E. et al. حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي للتعبير غير الفيروسي عن البروتينات في الكلى. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نقدم بروتوكول الحقن الهيدروديناميكي للبلازميدات في الحوض الكلوي لكلية الفأر من أجل تعداء الحمض النووي. تسمح هذه التقنية بتوصيل البلازميدات الخاصة بالأعضاء من خلال استخدام مبدأ الضغط الهيدروستاتيكي العالي ، والذي يدفع البلازميدات بقوة إلى موقع معين دون التسبب في إصابة الأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إجراء جراحة حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي

1. اختر الفئران بعناية للجراحة.
   ملاحظة: لم يتم ملاحظة الاختلافات الخاصة بالسلالات بعد ولكنها قد تكون ممكنة. كانت معظم الحقن على خلفيات C57BL / 6 أو FVB. تعمل حقن الحوض الكلوي بشكل أفضل في الفئران التي يتراوح عمرها بين 6 و 12 أسبوعا. في الفئران التي يزيد عمرها عن 16 أسبوعا ، يمكن أن يصل معدل الفشل إلى 50٪ عن طريق تصوير لوسيفيراز لأسباب غير واضحة. لوحظ نفس معدل الفشل المرتبط بالعمر لحقن وريد الذيل الهيدروديناميكي في الكبد ، لذلك قد يكون هذا قيدا عاما يتعلق بمبدأ الحقن الهيدروديناميكي. على نفس المنوال ، أظهر آخرون أن حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي في كبد الفئران الليفية ليس بنفس فعالية الكبد السليم ، لذلك قد يكون من الممكن ألا يكون الحقن الهيدروديناميكي للحوض الكلوي فعالا في حالات التليف الكلوي ، ولكن لم يتم اختبار ذلك بشكل مباشر.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الفئران ومحاقن الحمض النووي للجراحة

1. تخدير الفئران بالكيتامين والزيلازين.
   1. ارتد معدات الحماية الشخصية الصحيحة التي تتطلبها منشأة ، مثل ساحة المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ، وقناع الوجه الجراحي ، وقفازات النتريل.
   2. من خلال العمل مع 2-4 فئران في وقت واحد ، قم بوزن كل فأر في دورق بلاستيكي سعة 500 مل على مقياس دقيق يصل إلى 0.1 جم. احسب الكمية الصحيحة من 24 مجم / مل من الكيتامين و 2 مجم / مل من الزيلازين المخفف في محلول ملحي عادي 0.9٪ لإدارته لكل فأر عن طريق الحقن داخل الصفاق (انظر الفيديو المشار إليه لمعرفة المزيد عن الحقن داخل الصفاق). استخدم الصيغة (50 ميكرولتر + ((5 ميكرولتر) × (الوزن (جم))) ، أو بدلا من ذلك احسب وفقا لصيغة أخرى بعد التشاور مع الفريق البيطري المحلي و IACUC.
   3. حقن الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق بالتقنيات القياسية. ضع الماوس في دلو ورقي حتى يصبح الماوس غير متحرك.
      ملاحظة: تكون الفئران جاهزة للجراحة عندما لا تستجيب لاختبار قرصة إصبع القدم. أعط الفئران التي تستمر في الاستجابة لاختبار قرصة إصبع القدم بعد 20-30 دقيقة من الحقن الأولي 20-60 ميكرولتر أكثر تخديرا ، اعتمادا على قوة الاستجابة.
   4. ضع الماوس على وسادة حرارية مدورة بالماء مغطاة بفوطة زرقاء وضع مرهم بيطري في كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
2. احلق الجانب الأيسر من الجزء الخلفي من الماوس من الكتف إلى الردف ومن الجناح إلى العمود الفقري باستخدام ماكينة حلاقة مصممة للعناية بالحيوانات الأليفة. إزالة الشعر المتساقط والحطام.
3. قم بإعداد حقنة منفصلة تحتوي على 100 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف لكل فأر مخدر ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
   1. استخدم حقنة أنسولين معقمة مقاس 29 جم × 1/2 بوصة 0.5 مل U-100 بإبرة متصلة بشكل دائم بدون أمان.
      ملاحظة: نوع المحقنة له أهمية حاسمة. يسمح هذا المقياس بالحقن السريع. تمنع الإبرة المرفقة بشكل دائم المحلول من التسرب. سيعيق وجود الأمان الوصول إلى الحوض الكلوي. تنزلق المحاقن المحددة في جدول المواد بشكل متساو أثناء الحقن أكثر من العلامات التجارية الأخرى التي تم اختبارها.
   2. قم بتحميل المحقنة إلى ~ 120 ميكرولتر واسحب المكبس لأسفل لإنشاء مساحة في الأعلى. اضغط بقلم حتى ترتفع جميع فقاعات الهواء إلى الأعلى. أمسك الإبرة لأعلى ، واضغط بعناية على المكبس لإزالة كل الهواء حتى تتشكل قطرة عند طرف الإبرة. لا ينبغي أن يكون هناك أي فقاعات مرئية ، لأنها قد تسبب انسداد هوائي يقتل.
   3. قم بإنهاء الضغط على المكبس حتى يكون هناك 100 ميكرولتر في المحقنة عن طريق إفراغ محلول الحمض النووي الزائد في أنبوب الطرد الدقيق الأصلي. قم بوضع الملصقات بعناية إذا لزم الأمر وضع المحاقن المحملة على ستارة معقمة للحفاظ على العقم إذا كانت المنشأة التي يتم فيها تنفيذ العمل لا تسمح بإعادة تغليف الإبر.

< p class = "jove_title" >3. إجراء جراحة الحقن

1. جهز الموقع للجراحة. ضع ستارة معقمة فوق وسادة الحرارة وأفرغ الأدوات الجراحية المعقمة على الستارة المعقمة دون لمسها. التقط الماوس وضعه في مجال الرؤية. اضبط الإضاءة لإضاءة المنطقة.
2. قم بإزالة ثلاث مسحات مطهرة للجلد 3.15٪ كلورهيكسيدين و 70٪ من كحول الأيزوبروبيل من العبوات وضعها بالقرب من.
3. التغيير إلى قفازات جراحية معقمة. من خلال العمل بحركة دائرية تبدأ من موقع الشق ، قم بمسح بمسحة كلورهيكسيدين / كحول جديدة ثلاث مرات.
4. حدد موقع الشق كما هو موضح في الشكل 1 أ. اضغط على الجلد بالملاقط ، استخدم المقص لعمل قطع في طبقة الجلد على بعد حوالي 1 سم من العمود الفقري وتحت القفص الصدري. بمجرد أن يبلغ طول موقع القطع حوالي 1 سم ، قم بعمل موقع قطع مماثل أدناه ، في طبقة العضلات.
   ملاحظة: اجعل الشق بالطول المناسب للسماح للكلية بالمرور بالكاد من خلال الشق ثم تبقى في مكانها بواسطة الشق نفسه. شق صغير جدا ولا يمكن الكشف عن الكلى ؛ كبيرة جدا وسوف تنزلق الكلية باستمرار إلى تجويف البطن.
5. حدد موقع الكلى.
   ملاحظه: قد يكون مرئيا بين الأنسجة الدهنية البيضاء. يقع الطحال أيضا على الجانب الأيسر من. يمكن تمييز لون هذه الأعضاء بصريا ، حيث أن الطحال كستنائي غامق بينما الكلى حمراء برتقالية داكنة. ليس من المرغوب فيه التلاعب بالطحال لأنه يمكن أن يتمزق بسهولة.
6. دون لمس الكلية ، قم بتعريضها برفق من تجويف البطن عن طريق الضغط الثابت واللطيف على البطن بالأصابع (الشكل 2 ج). استخدم ملاقط مغلقة لدفع الأعضاء غير المرغوب فيها برفق إلى البطن إذا لزم الأمر. لا تستخدم الملقط المفتوح لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الكلى أو الأعضاء الأخرى.
7. بمجرد خروج الكلية من البطن ، افصلها برفق عن الدهون المحيطة بما يكفي لتصور الحوض الكلوي ، وهي نقطة بيضاء صغيرة (الشكل 1 ب). ادفع الدهون الزائدة إلى جانب واحد أو قم بإزالتها إذا لزم الأمر. تأكد من عدم إزالة الغدة الكظرية الموجودة بالقرب من القطب العلوي للكلية أو كبسولة الكلى.
8. باستخدام ملقط مغلق للضغط على الجانب الأيمن من الكلية بحيث يظل الحوض الكلوي في الأفق ، أمسك حقنة الأنسولين المحملة باليد اليمنى وامسكها بالتوازي مع سطح العمل مع توجيه الإبرة إلى الحوض الكلوي (الشكل 2E). أدخل الإبرة بعناية في الحوض الكلوي للكلية الجمودة كما هو موضح في الشكل 1 ب.
9. حقن المحلول بسرعة في غضون ثلاث ثوان. قد ينظف حوالي ثلث الكلى ويتغير لونها إلى اللون الأبيض.
   ملاحظة: من الشائع ملاحظة تراكم السوائل في كبسولة الكلى بعد الحقن وكذلك تكوين ورم دموي. بعض الضرر ضروري لتحقيق مستوى كاف من تعداء الحمض النووي للكشف.
10. احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 ثوان تقريبا لمنع التدفق العكسي للمحلول. ثم قم بإزالة الإبرة بعناية وببطء. أعد العضو إلى تجويف البطن عن طريق شد موقع الشق برفق واستخدام ملقط مغلق.
11. خياطة طبقة العضلات للحيوان ب 5-0 خيوط قابلة للامتصاص ، مع وضع 2-4 عقدة مستقلة.
12. خياطة طبقة جلد ب 5-0 أو 6-0 خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص ، مع وضع 2-4 عقدة مستقلة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الأدوات الجراحية بعد وضعها في حمام معقم من الخرز وتبريدها.

النتائج

الشكل 1. تصحيح موقع الشق ووضع الإبرة لحقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي. أ) يجب أن يكون الشق (الخط الأحمر) على بعد حوالي 1 سم من العمود الفقري وحوالي 1 سم تحت القفص الصدري للفأر. ب) بعد تعرض الكلية عبر شق الخاصرة ، يجب وضع الحوض الكلوي كنقطة صغيرة شفافة / بيضاء صفراء في منتصف الكلى. يجب ألا يزعج الحقن الوريد الكلوي أو الشريان الكلوي أو الحالب. يتم إدخال إبرة حقنة الأنسولين مباشرة في ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أناسد زيلازين باترسون البيطري 07-808-1947 مخدر - مادة غير خاضعة للرقابة BD حقنة أنسولين 0.5 مل 29 جم 1/2 بوصة صحة الكاردينال 309306 المحاقن المطلوبة بوبرينيكس صيدلي / طبيب بيطري تسكين الألم - مادة خاضعة للرقابة مقص تشريح دقيق فائق الدقة أداة Roboz الجراحية RS-5882 أداة جراحية مضخة حرارية Gaymar باراجون ميديكال تي بي -700 مضخة حرارية تعميم المياه نبات 500 أداة Roboz الجراحية DS-401 لإعادة استخدام الأدوات الجراحية أثناء الجراحة ملقط Graefe أداة Roboz الجراحية RS-5136 أداة جراحية ملقط الأنسجة Graefe أداة Roboz الجراحية RS-5153 أداة جراحية حامل إبرة هالسي ، بطول 5 بوصات أداة Roboz الجراحية RS-7841 أداة جراحية وسادات حرارية - 15 × 21 بوصة - تحتاج إلى 3 على الأقل باراجون ميديكال تي بي 22 جي للاستخدام مع مضخة حرارية Gaymar الكيتامين صيدلي / طبيب بيطري مخدر - مادة خاضعة للرقابة مسحات Prevantics ثيرمو فيشر العلمي 23-100-110 لجراحة الجلد التحضيرية خيوط Prolene 5-0 تفتق 30 " ثيرمو فيشر العلمي NC0256891 خيوط غير قابلة للامتصاص للبشرة مرهم بصري ماركة Puralube باترسون البيطري 07-888-2572 للحفاظ على رطوبة العينين أثناء الجراحة خيوط فيكريل 5-0 J303H ثيرمو فيشر العلمي NC9816710 خيوط قابلة للامتصاص لطبقة العضلات وال ميني أركو كليبر ميد بيطري إنترناشيونال أنا 8787-1550 ماكينة حلاقة لإعداد البشرة