تحليل تعبير البروتين القائم على مصفوفات البروتين في المرحلة العكسية: إجراء للقياس الكمي المتزامن للتعبير عن بروتينات متعددة من محللة الخلية

الملخص

المصدر: O'Mahony، F. C. et al. استخدام مصفوفات البروتين ذات الطور العكسي (RPPA) لاستكشاف تباين تعبير البروتين داخل سرطانات الخلايا الكلوية الفردية. J. Vis. Exp. (2013)

يوضح هذا الفيديو منهجية أداء مصفوفات بروتين الطور العكسي (RPPA) لدراسة أنماط تعبير البروتين من محللة الخلية. في RPPA ، تتم طباعة المحللة التي تحتوي على خليط من البروتينات على شرائح النيتروسليلوز ويتم تحليل البروتينات ذات الأهمية باستخدام الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية.

البروتوكول

فئة

1. طباعة RPPA

1. تم رصد محللات البروتين على شرائح زجاجية مطلية بالنيتروسليلوز (Fastslides-Whatman) باستخدام نصاب آلي MicroGrid II. احتوت الشرائح المستخدمة على 2 وسادات تم رصد العينات عليها. تم رصد كل وسادة بعينات متطابقة ، في هذه الحالة ، 100 عينة. تشمل التنسيقات الأخرى المتاحة 1 و 8 و 16 شريحة وسادة. كلما زاد عدد الوسادات ، قل عدد العينات التي يمكن رصدها على كل منها.
2. تم إجراء سلسلة من خمسة تخفيفات 2 أضعاف من كل عينة ثم تم رصد كل منها في ثلاث نسخ (مما أدى إلى ما مجموعه 15 نقطة لكل عينة).

فئة

2. كشف بروتين RPPA

1. ينزلق مبلل في المخزن المؤقت الزائد لحجب LiCor (مخفف بنسبة 50:5....

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. مخطط التدفق لعملية مسح RPPA.

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تريتون X-100 تريتون-إكس تي 8787 Li-Cor Odyssey حجب المخزن المؤقت ليثيوم كور 927-40000 MicroGrid II المراقب الآلي الروبوتات الحيوية حامل الشرائح رباعي الخليج FastFrame واتمان 10486001 شريحة سريعة - 2-وسادة واتمان 10485317 IRDye 680LT الماعز المضاد للفأر IgG ليكور 926-68020 IRDye 800CW الماعز المضادة للأرانب IgG ليكور 926-32211