تحليل تعبير البروتين القائم على مصفوفات البروتين في المرحلة العكسية: إجراء للقياس الكمي المتزامن للتعبير عن بروتينات متعددة من محللة الخلية

الملخص

المصدر: O'Mahony، F. C. et al. استخدام مصفوفات البروتين ذات الطور العكسي (RPPA) لاستكشاف تباين تعبير البروتين داخل سرطانات الخلايا الكلوية الفردية. J. Vis. Exp. (2013)

يوضح هذا الفيديو منهجية أداء مصفوفات بروتين الطور العكسي (RPPA) لدراسة أنماط تعبير البروتين من محللة الخلية. في RPPA ، تتم طباعة المحللة التي تحتوي على خليط من البروتينات على شرائح النيتروسليلوز ويتم تحليل البروتينات ذات الأهمية باستخدام الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية.

البروتوكول

فئة

1. طباعة RPPA

1. تم رصد محللات البروتين على شرائح زجاجية مطلية بالنيتروسليلوز (Fastslides-Whatman) باستخدام نصاب آلي MicroGrid II. احتوت الشرائح المستخدمة على 2 وسادات تم رصد العينات عليها. تم رصد كل وسادة بعينات متطابقة ، في هذه الحالة ، 100 عينة. تشمل التنسيقات الأخرى المتاحة 1 و 8 و 16 شريحة وسادة. كلما زاد عدد الوسادات ، قل عدد العينات التي يمكن رصدها على كل منها.
2. تم إجراء سلسلة من خمسة تخفيفات 2 أضعاف من كل عينة ثم تم رصد كل منها في ثلاث نسخ (مما أدى إلى ما مجموعه 15 نقطة لكل عينة).

فئة

2. كشف بروتين RPPA

1. ينزلق مبلل في المخزن المؤقت الزائد لحجب LiCor (مخفف بنسبة 50:50 في PBS). احتضن في RT لمدة 1 ساعة على منصة هزازة.
2. قم بإعداد 800 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في LiCor Blocking Buffer (مخفف بنسبة 50:50 في PBS) بالتركيزات المرغوبة واستمر في وضع الثلج.
3. قم بتركيب الشرائح إما في (1) مشبك رقاقة الإطار الفردي أو (2) حامل الشرائح رباعي الفتحات "FastFrame" بحيث يتم تشكيل ختم محكم بين الشريحة وغرفة الحضانة.
4. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي من الآبار وأضف 600 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي إلى الآبار المعنية.
5. ضع الشريحة والغرفة في صندوق مبلل مغلق واحتضانها على منصة هزاز طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
6. تشكل 0.1٪ PBS-Tween20 (PBS-T ؛ 100 ميكرولتر توين 20/100 مل PBS).
7. قم بإزالة الشرائح من الغرفة الباردة وإزالة الأجسام المضادة الأولية بعناية من كل بئر.
8. أضف 600 ميكرولتر من PBS-T واغسل الشرائح على منصة هزاز عند RT لمدة 5 دقائق (X3).
9. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورسنت عن طريق التخفيف في Odyssey Blocking Buffer (مخفف بنسبة 50:50 في PBS) 0.01٪ SDS عند تخفيف 1: 2,000 (1 ميكرولتر / 2 مل) في المقام الأول.
10. قم بإزالة المخزن المؤقت من الآبار وأضف 600 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلورسنت إلى الآبار المعنية. احتضان الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع الرج اللطيف ؛ من المهم حماية الغشاء من الضوء حتى يحين الوقت الذي يتم فيه مسحه ضوئيا في النهاية.
11. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية من البئر واغسلها لفترة وجيزة (x3) في 600 ميكرولتر PBS-T في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الشريحة من الناقل ، وانقلها إلى وعاء مناسب واغسلها في PBS-T الزائد لمدة 15 دقيقة ، مع الحفاظ على الغشاء في الظلام.
12. قم بإزالة PBS-T وغسل الغشاء باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة Tween-20 المتبقي ، مع الحفاظ على الغشاء في الظلام مرة أخرى.
13. جفف Fastslide في فرن 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم قم بمسحه ضوئيا على الماسح الضوئي Li-Cor Odyssey. احتفظ بالشريحة في الظلام حتى يتم مسحها ضوئيا.
14. امسح الشريحة ضوئيا عند 680 نانومتر و / أو 800 نانومتر اعتمادا على الجسم المضاد / الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. للكشف عن اللونين ، استخدم دائما أجساما مضادة ثانوية عالية الامتصاص لتقليل التفاعل المتبادل. يعد الاختيار الدقيق للأجسام المضادة الأولية والثانوية ضروريا للكشف عن اللونين. من الأهمية بمكان اختيار الأنواع المضيفة المختلفة (مثل الأرانب والفأر) للجسمين المضادين الأساسيين. وهذا يسمح بالتمييز من خلال الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب والفئران والتي يتم تصنيفها بصبغة ذات أطياف انبعاث يمكن تمييزها بسهولة.
15. يتم حفظ ملفات الصور كملفات .tiff. يصور الشكل 1 صورة الملفات الممسوحة ضوئيا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. مخطط التدفق لعملية مسح RPPA.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تريتون X-100 تريتون-إكس تي 8787 Li-Cor Odyssey حجب المخزن المؤقت ليثيوم كور 927-40000 MicroGrid II المراقب الآلي الروبوتات الحيوية حامل الشرائح رباعي الخليج FastFrame واتمان 10486001 شريحة سريعة - 2-وسادة واتمان 10485317 IRDye 680LT الماعز المضاد للفأر IgG ليكور 926-68020 IRDye 800CW الماعز المضادة للأرانب IgG ليكور 926-32211