الحقن المجهري للسموم الكلوية في الوريد في جنين الزرد: تقنية لتوصيل العوامل السامة للكلية إلى مجرى الدم لجنين الزرد

الملخص

المصدر: McKee و Robert A. et al. الحقن المجهري للسموم الكلوية في أسماك الزرد لنمذجة إصابة الكلى الحادة. J. Vis. Exp.(2016)

يوضح هذا الفيديو الحقن المجهري للسموم الكلوية في وريد الذيل لجنين الزرد لدراسة آثارها الكيميائية على وظائف الكلى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

1. اصنع محلول مخزون 50x من وسائط الجنين E3 عن طريق خلط 73.0 جم كلوريد الصوديوم و 3.15 جم كلوريد كلوريد الصوديوم و 9.15 جم كلوريد_{الكالسيوم 2} و 9.95 جم MgSO₄ في 5 لتر من الماء المقطر ، وقم بتخزينها في RT.
2. اصنع محلول مخزون 50x من وسائط الجنين E3 عن طريق خلط 73.0 جم كلوريد الصوديوم و 3.15 جم كلوريد كلوريد الصوديوم و 9.15 جم كلوريد_{الكالسيوم 2} و 9.95 جم MgSO₄ في 5 لتر من الماء المقطر ، وقم بتخزينها في RT.
3. لزراعة أجنة أسماك الزرد ، قم بتخفيف محلول مخزون 50x من مخزون وسائط الجنين E3 إلى محلول عمل 1x بالماء المقطر ، ثم أضف 200 ميكرولتر من 0.05٪ من أزرق الميثيلين إلى كل 1 لتر من 1x E3 ليكون بمثابة مبيد للفطريات ، وقم بتخزينه في RT.
4. اصنع محلول مانع للتصبغ من وسط الجنين E3 باستخدام 0.003٪ 1-phenyl-2-thiourea (PTU) عن طريق الجمع بين 40 مل من مخزون 50x E3 مع 0.06 مجم PTU. ثم ارفع الحجم إلى إجمالي 2 لتر بالماء المقطر.
5. حرك E3 / PTU O / N في RT للحصول على مسحوق PTU في المحلول. بعد ذلك ، قم بتخزين E3 / PTU على RT.
   ملاحظه: تبلغ مدة صلاحية E3 / PTU حوالي أسبوع واحد ، وستكون المحاليل القديمة أقل فعالية في منع تطور التصبغ في يرقات سمك الزرد.
6. اصنع محلول مخدر بنسبة 0.2٪ تريكايين (MS-222) عن طريق إضافة 1 جم من التريكايين إلى 500 مل من الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 مع 1 M Tris ، الرقم الهيدروجيني 9.5.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الأدوات

1. قم بإعداد أداة مناور الأجنة ، المستخدمة لتحديد موضع الأجنة للحقن المجهري ، عن طريق إرفاق طرف تحميل الجل في نهاية إبرة تشريح مستقيمة مقاس 5 بوصات ، وتثبيتها بشريط لاصق أو غراء فائق.
2. قم بإعداد إبر الحقن المجهري باستخدام مجتذب الإبرة ، عن طريق وضع زجاج البورسليكات المصقول بالنار مقاس 10 سم مع خيوط في الجهاز وتأمين زجاج البورسليكات عن طريق شد المقابض.
3. اسحب زجاج البورسليكات لتصميم إبر مدببة دقيقة. استخدم الإعدادات التالية: الحرارة 540 ، والسحب 245 ، والسرعة 200 ، والوقت 125.
4. ضع الإبر داخل طبق بتري ، وعلقها على شريط من طين النمذجة لحماية أطراف الإبرة ، وحافظ على الطبق مغطى لمنع تراكم الغبار.
5. لإنهاء تحضير الإبرة للحقن المجهري ، استخدم شفرة حلاقة أو حافة ملقط دقيقة لقطع الطرف المسحوب للإبرة لإنشاء طرف حقن زاوي حاد بقطر حوالي 0.05-0.1 مم.
6. لصنع صينية الحقن المجهري ، قم بإعداد محلول 1.5٪ agarose / E3 في قارورة Erlenmeyer سعة 100 مل وقم بإذابة agarose عن طريق تسخين E3 ليغلي في الميكروويف ثم اتركه ليبرد في RT لمدة 10 دقائق تقريبا.
7. صب محلول الاغاروز المبرد / E3 في طبق بتري لعمل أساس بعمق 0.5 سم تقريبا. عندما يتجمد هذا ، اسكب طبقة ثانية بعمق حوالي 0.3 سم وأدخل قالب بئر الجنين الجاهز واسمح للأغروز بالتصلب عند RT.
   ملاحظه: عند إدخال القالب في طبقة أجار / E3 العلوية ، ضع القالب في الأجار بزاوية لتقليل عدد فقاعات الهواء.
8. عندما يتم ضبط صينية الحقن المجهري بالكامل ، ارفع الجنين الجاهز جيدا ببطء وحذر باستخدام مغرفة ، ثم املأ الطبق بمحلول E3 واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

فئة

3. الحقن المجهري لمحلول السموم الكلوية

1. في يوم الحقن ، قم بإعداد محلول السموم الكلوية المطلوب مع التحكم المناسب في السيارة.
2. دوامة أو امزج بلطف للتأكد من أن الدواء (الأدواء) في المحلول ، وفحص جوانب الأنبوب وأعلى عمود الماء.
   ملاحظه: يمكن تحضير محاليل السموم الكلوية لاحتواء كميات ضئيلة من ديكستران مترافق فلورسنت لمراقبة كفاءة الحقن المجهري وكذلك تقييم التصفية الكلوية في النقاط الزمنية اللاحقة.
3. قم بتحميل إبرة حقن دقيق مشذبة ب ~ 2-3 ميكرولتر من السموم الكلوية عن طريق ربط طرف تحميل هلام ناعم في الجزء الخلفي من الإبرة وتعليق الإبرة عموديا بقطعة من الشريط للسماح للمحلول بملء طرف الإبرة المشذب عن طريق الجاذبية.
4. بمجرد امتلاء طرف الإبرة ، قم بتأمين الإبرة المحملة في المشغل الدقيق.
5. اختبر حجم الحقن المجهري عن طريق وضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر وحقنها في الزيت لتقييم حجم القطرة. يبلغ قطر حجم الحقن 500 pl 0.1 مم.
6. قم بإزالة طبق الأجنة من الحاضنة وقم بتخديرها بإضافة ما يقرب من 5 مل من 0.2٪ تريكايين إلى طبق الجنين.
7. لضمان التخدير الكامل ، المس الجنين برفق بطرف أداة مناور الأجنة. قلة الحركة تشير إلى التخدير الكافي.
8. بعد التخدير الناجح ، انقل الأجنة إلى قالب الحقن باستخدام ماصة نقل.
9. قم بمناورة كل جنين في بئر مختلف من القالب ، ووضع الرأس في أعمق منطقة من البئر بحيث يستقر الجذع على طول الاكتئاب ويخرج الذيل من الاكتئاب.
10. أدخل الإبرة المملوءة في المعالج الدقيق وضع طرف الإبرة بجوار الجنين.
11. أدخل الإبرة برفق في وعاء الذيل عن طريق تحريك عصا التحكم للأمام واضغط على دواسة القدم لتوصيل الحقن المجهري.
    ملاحظه: يمكن قياس الحقن الناجح من خلال مشاهدة السائل يدخل الدورة الدموية. علاوة على ذلك ، فإن الحقن المشترك للمادة السامة للكلية مع ديكستران مترافق بالفلورسنت يمكن الباحث من التحقق من الحقن الناجح بعد الإجراء.
12. اسحب عصا التحكم برفق لإزالة الإبرة من الجنين.
13. بعد الحقن ، انقل الأجنة إلى طبق نظيف واشطفها لإزالة التريكايين واستبدلها ب E3 / PTU الطازج.
14. احتضان الجنين إلى النقطة الزمنية المطلوبة لتقييم التشكل ، والذي يمكن توثيقه عن طريق التصوير الفوتوغرافي في وسائط تركيب ميثيل السليلوز ، أو عملية التحليل التجريبي حسب الرغبة.
    ملاحظه: يجب تقييم تعافي الأجنة لتحديد النسبة المئوية للأفراد المصابين بالوذمة ، والتي تشير عادة إلى إصابة الكلى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم التحليل الحيوي الأمريكي AB01915 كلوريد البوتاسيوم التحليل الحيوي الأمريكي AB01652 كبريتات المغنيسيوم سيجما ألدريتش M7506 كلوريد الكالسيوم التحليل الحيوي الأمريكي AB00366 ن-فينيلثيوريا (PTU) ألدريتش كيمياء ص 7629 إيثيل 3-أمينوبنزوات (تريكايين) فلوكا التحليلية أ 5040 زجاج البورسليكات شركة سوتر للأدوات BF100-50-10 مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني شركة سوتر للأدوات مو P097 UltraPure Agarose إنفيتروجين 15510-027 أطباق بتري قابلة للغسل فالكون ، معقمة ، كورنينج: 60 مم × 15 مم VWR هاتف: 25373-085 100 مم × 15 مم VWR هاتف: 25373-100 صينية الحقن المجهري 150 مم × 15 مم VWR هاتف: 25373-187 حاضنة درجة حرارة منخفضة فيشر العلمية 11 690 516DQ ملاقط تشريح دقيقة شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5010 ميكرومتر تيد بيلا ، إنك. 2280-24