تحضير التركيب المسطح للكلى: إجراء لتشريح وإعداد حامل مسطح للتحليل المجهري لكلية الزرد البالغة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: McCampbell ، K. K. et al. تحليل تكوين النيفرون ووظيفته في كلية الزرد البالغة.J. Vis. Exp. (2014)

يوضح هذا الفيديو تشريح وتحضير حامل مسطح لكلية الزرد البالغة. يمكن تصور الحامل المسطح المحضر تحت المجهر لتحليل العينات.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تشريح وتحضير التركيب المسطح لكلية الزرد البالغة من عينة حيوانية غير مثبتة لتصور وضع العلامات الفلورية على الديكستران للأنبوب القريب

1. قم بالقتل الرحيم لسمك الزرد البالغ المحقون بالديكستران عن طريق وضعه في طبق به 0.2٪ درجة حموضة ثلاثية 7.0 لمدة 4-5 دقائق < br / > ملاحظه: تأكد من القتل الرحيم للأسماك قبل المتابعة ، من خلال المراقبة الدقيقة لما إذا كانت الخياشيم قد توقفت عن الحركة وتوقف القلب عن النبض.
2. باستخدام ملعقة بلاستيكية ، ارفع السمك من محلول Tricaine ، وصب المحلول وضع على منديل أو منشفة ورقية.
3. استخدم زوجا حادا من مقص التشريح لعمل قطع خلف الخياشيم وإزالة الرأس.
4. افتح جسم السمكة على الفور بمقص التشريح عن طريق عمل شق بطني طويل من الرأس إلى قاعدة الزعنفة الذيلية.
5. قم بإزالة الأعضاء الداخلية للأسماك باستخدام زوج من الملقط الناعم.
6. استخدم إبر تشريح فائقة الدقة لفتح جدران الجسم للسماح بتصور عضو الكلى الملتصق بالجدار الظهري للحيوان.
7. استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية عن الجدار الظهري.
8. ضع الكلية برفق في قارورة زجاجية سعة 5 مل تحتوي على 1X PBS واغسلها 3 مرات باستخدام 3-5 مل من 1X PBS الطازج لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   ملاحظه: يسهل استخدام قارورة زجاجية للتعامل مع عينات الكلى البالغة تصور الأنسجة ويسمح بالغسيل بكميات كبيرة (بالنسبة لكتلة الأنسجة) حوالي 3-5 مل. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبق ثقافة خلية مكون من 12 بئرا. بينما يمكن استخدام أنبوب الطرد المركزي الدقيق البلاستيكي ، فإن الأنابيب ذات الحجم القياسي (1.5 مل) يمكن أن تقيد الغسيل.
9. قم بإزالة الكلية بماصة نقل وضعها على شريحة زجاجية نظيفة مع 1-2 قطرات من 1X PBS.
10. استخدم ملقطا دقيقا ، وقم بتسطيح الكلى على الشريحة ، وتأكد من عدم تجعد أي نسيج أو انقلبت على نفسها.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أداة سلك التنغستن لعمل شقوق صغيرة في النسيج الضام لتسهيل وضع الكلى المسطح.
11. ضع قطعا صغيرة من طين النمذجة على كل ركن من أركان غطاء زجاجي مقاس 18 × 18 مم واضبط الغطاء ببطء على الكلى.
    ملاحظه: قم بزاوية الغطاء قليلا أثناء وضعه لتقليل فقاعات الهواء المحبوسة في المحلول. يبلغ قطر فتحات الطين النمذجة حوالي 2 مم (الشكل 1 أ). بدلا من ذلك ، يمكن استبدال فتحات الشحوم المفرغة بدلا من طين النمذجة. أضف قطرة إضافية من 1X PBS لملء الفراغ بين الغطاء والشريحة الزجاجية إذا لزم الأمر.
12. راقب و / أو قم بتصوير الكلى عن طريق وضع الشريحة الزجاجية في مجال الرؤية على مجهر مجسم أو مجهر مركب باستخدام المرشح المناسب.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تحضير وتطبيق التركيب المسطح لسمك الزرد البالغ لتصور امتصاص ديكستران المترافق في جزء معاهدة التعاون بشأن البراءات من النيفرون الكلى. (أ)صورة Brightfield لإعداد تثبيت مسطح لعينة الكلى ، حيث تم وضع العضو بشكل مسطح على شريحة زجاجية ، مع وضع غطاء فوق الأنسجة التي ترتكز على أربع فتحات من طين النمذجة (اللون الوردي الساخن). هنا يتم تصوير المستحضر الكلوي جنبا إلى جنب مع المسطرة المترية لتق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1X برنامج تلفزيوني مصنوع عن طريق تخفيف 10 × PBS في الماء المقطر. ملقط ناعم روبوز RS-1050 نمط ملاقط دومون # 55 شريحة زجاجية ثيرمو فيشر 4445 وايت فروست غطاء زجاجي ثيرمو فيشر 12-540 أ 18 × 18 ملم نمذجة الطين هاسبرو بلايدو يمكن استبدال طين النمذجة الأخرى والعمل بالمثل. حامل الشريحة ثيرمو فيشر 12-587 اختياري: صينية من الورق المقوى لتخزين الشرائح بشكل مسطح. مجهر مجسمة نيكون SMZ645; SMZ1000. 83455 P-Blue GFP / DAPI ؛ 83457 P-Endow GFP / FITC ؛ 83457 P-TRITC كانت مجموعة المرشحات المستخدمة على النحو التالي: تم استخدام مرشح Hoechst / DAPI للكشف عن DAPI ، يوديد البروبيديوم ، ديكستران - كاسكيد الأزرق والقلوي. تم استخدام مرشح GFP / FITC للكشف عن dextran-FITC و dextran lucifer yellow و antiGFP. تم استخدام مرشح TRITC للكشف عن ديكستران فلورو روبي و PI و DBA. مجهر مركب نيكون 96310 C-FL UV-2E / C DAPI ؛ 96311 C-FL B-2E / C FITC ؛ 96313 C-FL Y-2E / C تكساس ريد كانت مجموعة المرشحات المستخدمة على النحو التالي: تم استخدام مرشح Hoechst / DAPI للكشف عن DAPI ، يوديد البروبيديوم ، ديكستران - كاسكيد الأزرق والقلوي. تم استخدام مرشح GFP / FITC للكشف عن dextran-FITC و dextran lucifer yellow و antiGFP. تم استخدام مرشح Texas Red للكشف عن ديكستران فلورو روبي و PI و DBA.