مقالة منهجية

إزالة التصبغ وتلطيخ كلى الزرد: تقنية لتحضير كلية الزرد البالغة للتلطيخ

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: McCampbell ، K. K. et al. تحليل تكوين النيفرون ووظيفته في كلية الزرد البالغة. J. Vis. Exp. (2014)

في هذا الفيديو ، نوضح إزالة تصبغ الكلى البالغة من الزرد البالغ وإعدادها اللاحق لإجراءات التلوين. بعد التلوين ، يمكن استخدام كلية الزرد البالغة لدراسة تجديد الكلى ، والتوصيف الظاهري لنماذج أمراض الكلى ، ووظائف النيفرون.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التثبيت والتشريح والنفاذية وإزالة تصبغ كلية الزرد البالغة

  1. قم بإعداد محلول مثبت جديد بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) / 1X PBS / 0.1٪ DMSO أو قم بإذابة كمية مجمدة من 4٪ PFA / 1X PBS وأضف 0.1٪ DMSO.
    تنبيه: PFA سام ويجب التعامل مع محاليل PFA في غطاء كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التعامل مع مسحوق PFA بحذر عند صنع محلول المخزون.
  2. املأ صينية التشريح بمحلول مثبت كاف لغمر بأكمله.
  3. القتل الرحيم وتركيب سمك الزرد المختار في محلول التثبيت.
    ملاحظه: يمكن أن تكون الأسماك المختارة عينة من الكلى غير المعالجة من سمكة الزرد أو كلية معزولة من سمكة الزرد التي تلقت سابقا حقنة ديكستران داخل الصفاق.
  4. قم بإصلاح العينة O / N (12-16 ساعة) عند 4 درجاتمئوية.
  5. في اليوم التالي، استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية بعناية عن جدار الجسم الظهري ووضع العضو في قارورة زجاجية باستخدام ماصة النقل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبق ثقافة مكون من 12 بئرا أو 24 بئرا. بينما يمكن استخدام أنبوب الطرد المركزي الدقيق البلاستيكي ، فإن الأنابيب ذات الحجم القياسي (1.5 مل) يمكن أن تقيد الغسيل.
  6. اغسل الكلية المقطوعة 3 مرات باستخدام 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  7. قم بإزالة 1X PBS مع 0.05٪ Tween واشطف الكلى ب 3 مل من محلول السكروز 5٪ (في 1X PBS) لمدة 30 دقيقة.
  8. استبدل ب 3 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ (في 1X PBS) وقم بتخزين O / N (12-16 ساعة) عند 4 درجات مئوية
    ملاحظة: تعمل محاليل السكروز على اختراق الأغشية الخلوية ، مما يسمح لاحقا بوضع علامات محددة على الكواشف أثناء اختراقها للأنسجة.
  9. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول السكروز بنسبة 30٪ واغسل الكلى مرتين باستخدام 5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. استبدل 1X PBS بنسبة 0.05٪ Tween ب 3-5 مل من محلول التبييض لإزالة تصبغ الخلايا الصباغية الموجود على عضو الكلى.
  11. ضع قارورة زجاجية على دوار وراقب بعناية حتى يختفي التصبغ.
    ملاحظة: يستغرق إزالة التصبغ عادة حوالي 20 دقيقة عند إجراؤه بعد العلاج بالسكروز ، ولكن في بعض الأحيان قد يستغرق ما يصل إلى 60 دقيقة. إذا ترك محلول التبييض على الكلى لفترة طويلة ، يمكن أن يحدث تفكك العضو. ينصح بمراقبة العينة كل 10-15 دقيقة للتحقق من سلامة الأنسجة.
  12. عندما تتم إزالة التصبغ من الكلى ، اغسلها مرتين باستخدام 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين.
  13. استبدل 1X PBS ب 0.05٪ Tween ب 3-5 مل من محلول PFA 4٪ لمدة ساعة واحدة في RT.
  14. قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ واغسل الكلى 3 مرات باستخدام 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ Tween لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: بمجرد اكتمال التثبيت ، يمكن أيضا تركيب الكلية على شريحة زجاجية وتقييمها لامتصاص ديكستران بدون تصبغ الخلايا الصباغية.
  15. قم بإزالة 1X PBS مع 0.05٪ Tween واستبدلها ب 3-5 مل من محلول الحظر ، ثم احتضان الكلى في RT في الكتلة لمدة ساعتين.
  16. عند اكتمال الحجب ، انتقل مباشرة إلى بروتوكول التلوين المحدد.
    ملاحظة: يمكن الآن معالجة الكلية من خلال إجراء واحد أو أكثر من الإجراءات الأخرى من أجل إجراء دراسات وضع العلامات باستخدام كواشف مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1X برنامج تلفزيوني مصنوع عن طريق تخفيف 10X PBS في الماء المقطر 1X PBST 0.1٪ منظف Tween-20 في 1X PBS 1X PBS مع 0.05٪ توين 0.05٪ منظف Tween-20 في 1X PBS توين 20 التحليل الحيوي الأمريكي AB02038 4٪ PFA / 1X PBS قم بإذابة 4٪ PFA (وزن / حجم) (علوم المجهر الإلكتروني ، Cat # 19210) في 1X PBS ، واتركه ليغلي على طبق ساخن في غطاء الدخان. قم بتبريد وتجميد الكميات للتخزين في الفريزر عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج قبل الاستخدام مباشرة ولا تعيد تجميد المرق محلول التبييض تركيبة مزيج التبييض (لمحلول 20 مل): 1.6 مل من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم 10٪ 0.6 مل من محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ 100 ميكرولتر من 20٪ توين املأ إلى 20 مل بالماء المقطر هيدروكسيد البوتاسيوم سيغما 221473 بيروكسيد الهيدروجين سيغما H1009 حجب الحل محلول الحجب (لمحلول 10 مل): 8 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين 2 مل من مصل ربلة الساق الجنينية 150 ميكرولتر من DMSO

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PBS PFA

مقالات ذات صلة