مقالة منهجية

أمراض التمدد: طريقة للتصوير البصري عالي الدقة لعينات الأنسجة السريرية

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Klimas، A. et al. التصوير النانوي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع الفيزيائي والمتناحي.J. Vis. Exp.(2019)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة تسمى علم أمراض التمدد ، وهو نوع من الفحص المجهري التمدد ، حيث يتم توسيع عينات الأنسجة السريرية كيميائيا باستخدام شبكة بوليمر للفحص المجهري للهياكل النانوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. بلمرة العينات في الموقع

  1. احتضان العينة في محلول التثبيت.
    1. قم بإعداد محلول التثبيت (عادة ما يكون 250 ميكرولتر كافيا لتغطية قسم الأنسجة) عن طريق تخفيف محلول مخزون AcX في 1x PBS بتركيز 0.03 مجم / مل للعينات المثبتة بمثبتات غير الألدهيد أو 0.1 مجم / مل للعينات الثابتة بمثبتات الألدهيد ، والتي تحتوي على عدد أقل من الأمينات الحرة المتاحة للتفاعل مع AcX.
    2. ضع الشريحة في طبق بتري مقاس 100 مم وقم بسحب محلول التثبيت فوق الأنسجة. احتضان لمدة 3 ساعات على الأقل في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  2. احتضان العينات في محلول التبلور.
    1. قم بإعداد حجم زائد لا يقل عن 100 ضعف من محلول التبلور. لكل 200 ميكرولتر ، اجمع بين ما يلي بالترتيب: 188 ميكرولتر من محلول المونومر ، 4 ميكرولتر من محلول مخزون 4HT 0.5٪ (تخفيف 1:50 ، التركيز النهائي: 0.01٪) ، 4 ميكرولتر من محلول مخزون TEMED بنسبة 10٪ (تخفيف 1:50 ، التركيز النهائي 0.2٪) ، و 4 ميكرولتر من محلول مخزون APS بنسبة 10٪ (تخفيف 1:50 ، التركيز النهائي 0.2٪).
      ملاحظة: يجب عمل محلول التبلور مباشرة قبل الاستخدام. يجب أن يحفظ المحلول عند 4 درجات مئوية ويجب إضافة محلول APS أخيرا ، لمنع التبلور المبكر.
    2. قم بإزالة المحلول الزائد من قسم الأنسجة وضع الشريحة في طبق بتري 100 مم. أضف محلول التبلور الطازج البارد إلى العينة واحتضن الخليط على الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، للسماح بانتشار المحلول في الأنسجة.
  3. قم ببناء غرفة على الشريحة حول العينة (الشكل 1 أ) دون إزعاج محلول التبلور.
    1. اصنع فواصل لغرفة التبلور عن طريق قطع رقيقة من زجاج الغطاء باستخدام سكين ماسي.
      ملاحظة: لتسهيل التصوير بعد التمدد ، يجب أن تكون الفواصل قريبة من سمك عينة الأنسجة لتقليل كمية الجل الفارغ فوق الأنسجة. يمكن استخدام الزجاج رقم 1.5 للعينات السريرية القياسية (5-10 ميكرومتر). يمكن تكديس قطع الزجاج للغطاء للحصول على عينات أكثر سمكا.
    2. قم بتأمين الفواصل على جانبي الأنسجة باستخدام قطرات من الماء (~ 10 ميكرولتر).
    3. ضع غطاء زجاجي بعناية فوق الشريحة ، مع التأكد من تجنب حبس فقاعات الهواء فوق الأنسجة (الشكل 1 ب).
  4. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة (مثل طبق بتري مغلق بمنديل رطب) لمدة 2 ساعة < br / > ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين حجرة الانزلاق داخل طبق بتري مغلق عند 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >2. عينة الهضم

  1. قم بإزالة غطاء حجرة التبلور عن طريق تحريك شفرة الحلاقة برفق أسفل الغطاء ورفع الغطاء ببطء عن سطح الجل. قم بقص الجل الفارغ حول الأنسجة لتقليل الحجم. قم بقص الجل بشكل غير متماثل لتتبع اتجاه الجل بعد التجانس ، حيث ستصبح العينة شفافة.
    1. خفف ProK بمقدار 1: 200 في محلول الهضم (التركيز النهائي 4 وحدة / مل) قبل الاستخدام. تحضير محلول كاف لغمر الجل تماما ؛ يتطلب بئر واحد من لوحة زراعة الخلايا البلاستيكية المكونة من أربعة آبار 3 مل على الأقل لكل بئر.
    2. احتضان العينة في وعاء مغلق يحتوي على عازلة الهضم لمدة 3 ساعات عند 60 درجة مئوية. إذا لم تنفصل العينة عن الشريحة أثناء الهضم ، فاستخدم شفرة حلاقة لإزالة العينة برفق.
      ملاحظة: يجب غمر العينة بالكامل في عازلة الهضم لمنع العينة من الجفاف ووضعها في حاوية مغطاة (صندوق منزلق صغير ، بئر بلاستيكي ، طبق بتري ، إلخ) يمكن إغلاقها بالفيلم.

3. توسيع العينة والتصوير

  1. استخدم فرشاة رسم ناعمة لنقل العينة إلى 1x PBS في حاوية متوافقة مع نظام التصوير المطلوب وكبيرة بما يكفي لاستيعاب الجل الموسع بالكامل. تأكد من وضع الأنسجة مع وضع جانب العينة لأسفل إذا كان التصوير على نظام مقلوب أو لأعلى إذا كان التصوير على نظام عمودي لتقليل المسافة من هدف التصوير إلى العينة. اقلب الجل باستخدام فرشاة رسم ناعمة إذا لزم الأمر.
    ملاحظه: يمكن استخدام الإضاءة الجانبية من LED لجعلها مرئية في السائل. يمكن أن تستوعب اللوحة القياسية المكونة من 6 آبار العينات التي يقل قطرها الموسع مسبقا عن 0.6 سم. يجب استخدام صفيحة بئر ذات قاع زجاجي للتصوير على نظام مقلوب.
  2. اغسل العينات في 1x PBS في RT لمدة 10 دقائق. إذا رغبت في ذلك ، أعد تلطيخ العينة ب 300 نانومتر DAPI لأن عملية الهضم تغسل بقعة DAPI. قم بإزالة PBS والبقع باستخدام 300 نانومتر DAPI مخفف في 1x PBS لمدة 20 دقيقة في RT ، متبوعا بغسل لمدة 10 دقائق مع 1x PBS عند RT.
    ملاحظة: يمكن تغطية العينات ب 1x PBS وتخزينها عند 4 درجات مئوية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. لتوسيع العينات، استبدل برنامج تلفزيوني واغسله بحجم زائد قدره ddH2O (على الأقل 10 أضعاف حجم الهلام النهائي) 3-5 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما، عند RT.
    ملاحظه: بعدالغسيل 3 أو 4 ، يجب أن يبدأ توسع العينة في الهضبة. للتخزين ، لمنع نمو البكتيريا ، يمكن استكمال ddH2O ب 0.002٪ -0.01٪ أزيد الصوديوم (NaN3). في هذه الحالة ، يتم تقليل عامل التمدد النهائي بشكل عكسي بنسبة 10٪.
  4. قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر تقليدي واسع المجال أو مجهر متحد البؤر أو أي نظام تصوير آخر من اختياره.
    ملاحظه: لمنع المواد الهلامية من الانجراف ، يمكن إزالة السوائل الزائدة من البئر. يمكن أيضا تجميد المواد الهلامية باستخدام 1.5-2٪ من الاغاروز منخفض الذوبان. تحضير 1.5-2٪ (وزن / حجم) من الاغاروز منخفض الذوبان في الماء في وعاء 2-4 أضعاف حجم المحلول. قم بتسخين المحلول في حمام مائي 40 درجة مئوية أو في الميكروويف لمدة 10-20 ثانية لإذابة المحلول. ماصة الاغاروز المذاب حول حواف الجل. بعد السماح للأغاروز بالتصلب عند RT أو 4 درجات مئوية ، أضف الماء إلى العينة لمنع الجفاف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: غرفة التبلور لعينات علم الأمراض. (أ) يتم وضع فوارضين ، مثل قطعتين من زجاج الغطاء # 1.5 المقطوع بسكين ماسي ، على جانبي الأنسجة بعد احتضان العينة في محلول التبلور عند 4 درجات مئوية. يجب أن تكون الفواصل أكثر سمكا من شرائح الأنسجة ، لمنع ضغط العينة. (ب) يتم استخدام غطاء ، مثل قطعة من زجاج الغطاء # 1.5 ، لتغطية العينة قبل الحضانة عند 37 درجة مئوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 آبار لوحة زجاجية قاع (# 1.5 غطاء زجاجي) سيلفيس P06-1.5H-N أسيتون فيشر ساينتيفك أ 18-500 أكريلاميد سيجما ألدريتش أ 8887 أكريلويل إكس إس إي (ACX) إنفيتروجين أ20770 أغاروز فيشر ساينتيفك بي بي 160-100 بيرسلفات الأمونيوم (APS) سيجما ألدريتش أ 3678 البادئ DAPI (1 مجم / مل) الترمو: العلمية 62248 وصمة عار نووية سكين الماس رقم 88 سم أدوات عامة 31116 ايثانول فارمكو 111000200 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) 0.5 م VWR BDH7830-1 عينة الكلى FFPE يو إس بي ماكس هوFPT072 ملقط غطاء صغير زجاج # 1 (24 مم × 60 مم) VWR 48393 106 غطاء صغير زجاج # 1.5 (24 مم × 60 مم) VWR 48393 251 N ، N ، N ′ ، N ′ - TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED) سيجما ألدريتش تي 9281 مسرع N ، N ′-ميثيلين بيساكريلاميد سيجما ألدريتش [م7279] طبق ثقافة الخلايا Nunclon 6-Well ثيرمو فيشر 140675 Nunc 15 مل مخروطي الشكل ثيرمو فيشر 339651 Nunc 50 مل مخروطي الشكل ثيرمو فيشر 339653 شاكر مداري فرشاة الطلاء مقياس الأس الهيدروجيني محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 10x فيشر ساينتيفك ص399-1 طبق بتري بلاستيك (100 مم) فيشر ساينتيفك FB0875713 البروتيناز K (درجة البيولوجيا الجزيئية) الترمو: العلمية EO0491 شفرة الحلاقة فيشر ساينتيفك 12640 [م] أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Safelock 1.5 مل ثيرمو فيشر 3457 أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة Safelock 2.0 مل ثيرمو فيشر 3459 أكريلات الصوديوم سيجما ألدريتش 408220 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش الطراز S6191 سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدرات سيجما ألدريتش C8532-1 كجم قاعدة تريس فيشر ساينتيفك ص ب 152-1 تريتون X-100 سيجما ألدريتش تي 8787 الزيلين سيجما ألدريتش 214736

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Expansion PathologyExpansion MicroscopyPolymer NetworkAnchoring SolutionGelling SolutionProteinase DigestionFluorescence ImagingTissue ExpansionConventional Light MicroscopyNanoscale Imaging

مقالات ذات صلة