$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. وصول الماصة الجانبية إلى الكلى أسفل عمود تصوير السوائل عبر إجراء جراحي جديد
ملاحظة: يظهر تجميع نظام دعم التصوير والإعداد الجراحي في الشكل 1. يتم تنفيذ الإجراء الموصوف على فئران C57BL / 6 التي تزن 20-25 جم.
- وزن الماوس.
- تحفيز التخدير باستخدام 4٪ إيزوفلوران والحفاظ على 1.5-2.5٪ إيزوفلوران في خليط الهواء / الأكسجين. تأكد من أن الفأر مخدر بسبب عدم الاستجابة للتحفيز المؤلم وانخفاض معدل التنفس.
- قم بتليين العينين ووضع الجانبي على صفيحة أساسية. شل حركة 4 أطراف باستخدام شريط لاصق.
- حقن محلول ملحي عادي ، 200 ميكرولتر ، تحت الجلد ووضع مسبار درجة حرارة المستقيم. التحكم في درجة الحرارة باستخدام مصباح التسخين أثناء الجراحة ووسادة التدفئة أثناء التصوير.
- قم بإزالة كل الشعر على الجانب الأيسر من الماوس باستخدام كريم مزيل الشعر.
- حدد موقع الطحال المرئي تحت الجلد وحدد موقع الكلية اليسرى على الجانب الظهري والذيلي من الطحال.
- قم بعمل شق 0.5 سم على الجلد وشق أصغر على الصفاق ، وهو ما يكفي فقط للكلية للدفع بسهولة.
- بثق الكلى بضغط لطيف. ضع شكل مثبت الكلى المصنوع من البولي سيلوكسان حول الكلى وثبته بمادة لاصقة سيانواكريلات. تصطف الكلية مع الفاصل بحيث يمتد السطح الجانبي للكلية إلى ما وراء المثبت بحوالي 1 مم.
- قم بتثبيت لوحة الرأس على شكل المثبت بالغراء وقم بتركيب لوحة الرأس على قضبان التثبيت على لوحة القاعدة.
- املأ البئر في دعامة البولي سيلوكسان المحيطة بالكلى بمحلول الاغاروز بنسبة 1٪ وضع غطاء الغطاء 10 مم في الأعلى واستمر حتى يصبح الاغاروز متماسكا. قم بإغلاق غطاء الغطاء على لوحة الرأس بالغراء وقم بإنشاء حلقة حول الغطاء باستخدام الأسمنت الأسنان.
- حقن FITC-dextern (2،000،000 Da ، محلول 5٪ ، 100-150 ميكرولتر) بشكل رجعي ونقل الماوس ولوحة التثبيت إلى مرحلة المجهر ثنائي الفوتون بسرعة ، مع الحفاظ على التخدير وضمان التنظيف الكافي لغازات النفايات في مرحلة المجهر.
فئة
2. اختيار كبيبة مناسبة ووصول ماصة إلى مساحة بومان
- التعاريف:
- حدد X على أنه من اليسار إلى اليمين على الشاشة واليسار واليمين في مواجهة المجهر
- قراءة SX (المرحلة X) من وحدة التحكم في المرحلة
- تعريف PX على أنها ماصة X، على وحدة التحكم في قرص الماصة
- حدد Y على أنه من أعلى إلى أسفل على الشاشة وإلى الأمام باتجاه المجهر والعودة نحو إعداد الفوتون 2
- حدد Z على أنه لأعلى باتجاه السقف ، لأسفل باتجاه الأرض ، ويتم قياسه على المسرح بموضع Z الموضوعي.
- حدد S (O) Z على أنه ارتفاع المرحلة (الهدف حقا).
- ابحث عن سطح الكلى ، الذي يمكن التعرف عليه باستخدام إعدادات مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في العين. بسبب حقن FITC-Dextaren ، سيكون الأوعية الدموية خضراء زاهية.
- تحديد الكبيبة المناسبة. بعد تحديد سطح الكلية باستخدام العين ، قم بالتبديل إلى 2-photon (وضع عدم المسح) واستكشف نافذة التصوير. الخصائص المواتية للبزل الدقيق هي كما يلي: المسافة الرأسية أسفل انزلاق الغطاء >30 ميكرومتر (لمنع الاصطدام بين الماصة والغطاء أثناء الوصول) والمسافة الجانبية من كبسولة الكلى الجانبية إلى الكبيبة <400 ميكرومتر (بعد هذه المسافة قد يزيد انحراف الماصة من احتمالية حدوث خطأ).
- سجل المسافة الجانبية والرأسية إلى نقطة البزل، وهي نقطة على الكبسولة الكلوية مباشرة إلى جانب الماصة من الكبيبة.
- ارفع النقطة المحورية الموضوعية في عمود الماء ، مع الحفاظ على إحداثيات المرحلة x و y دون تغيير ، حوالي سنتيمتر واحد.
- ادفع طرف الماصة إلى عمود الماء وقم بتشغيل إثارة 4 بوصات ، 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). حرك الماصة في الأبعاد x و y إلى نقطة التألق الأقصى للطرف ، وسيكون هذا هو مركز الهدف. من الصعب العثور على الماصة في العين بدون هذا الإعداد الدقيق للنسب. نظرا لأن النقاط الكمومية تتألق في نفس الطول الموجي (في هذه الحالة ، أحمر) بغض النظر عن الطول الموجي للإثارة ، فإن إثارة DAPI تنتج مضان أحمر ، والذي يركز بإحكام على الطرف ، كما هو موضح في الشكل 2.
- قم بتغيير إعداد الإثارة إلى بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) وتصور الماصة في العين، ثم قم بتوسيطها بدقة في عرض العين.
- قم بالتبديل إلى 2-photon وابحث عن الماصة تحت 2-photon ، ووضعها بدقة في وسط الصورة. هذا هو موقف التسجيل.
- احفظ صورة الماصة.
- تسجيل المرحلة وإحداثيات وحدة التحكم في الماصة الدقيقة.
ملاحظه: استخدم ملف .html التكميلي، الذي سينفذ العمليات الحسابية باستخدام كود JavaScript (مفيد للأنظمة التي لا تحتوي على برنامج جداول بيانات مثبت) أو جدول بيانات لحساب الإزاحة بين إحداثيات المرحلة والماصة ولحساب الإحداثيات المستهدفة لوحدة التحكم في الماصة.
- قم بإزالة الماصة من عمود الماء في المحور x ، مع الحفاظ على z و y كما هي.
- حرك الماصة Z إلى الكبيبة المستهدفة Z (أي حرك الماصة لأسفل في الاتجاه Z أسفل الغطاء)
- حرك الماصة Y إلى إحداثيات الكبيبة Y المستهدفة.
- انقل المنظر المباشر المكون من 2 فوتون إلى الكبيبة المستهدفة Z ثم إلى حافة الكلى ولاحظ SX.
- احسب حافة الكلى PX باستخدام الإزاحة من SX التسجيل.
- حرك المرحلة باتجاه الماصة (قم بزيادة SX) بحيث تكون حافة الكلية بعيدة عن يسار الشاشة ، ولكنها لا تزال مرئية.
- ادفع الماصة بسرعة إلى حوالي 100 ميكرومتر أقل من PX حافة الكلى المحسوبة أعلاه.
- حدد موقع طرف الماصة، مع دفع الماصة ببطء. قم بزيادة الكسب الأحمر ومشاهدة الرسم البياني للبكسل الأحمر (يتغير توزيع البكسل قبل تصوير الماصة في النافذة ، بسبب السطوع الشديد للنقاط الكمومية والتألق خارج الهدف).
- تقدم إلى حافة الكلى تحت التصوير المباشر 2 فوتون.
ملاحظه: قبل دخول الكبسولة الكلوية ، من الممكن إعادة توجيه الماصة في البعدين Y و Z. ومع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى كسر طرف الماصة. الإجراء الأكثر تحفظا ، إذا كانت الماصة بعيدة عن الهدف ، هو الانسحاب في البعد X حتى 2 سم ، وإعادة التوجيه ، ثم العودة في البعد X إلى حافة الكلى. بمجرد أن تكون الماصة داخل الأنسجة، تؤدي الحركة في أي محور آخر غير X إلى ثني الماصة التي تتطلب خبرة كبيرة للاستفادة منها، وغالبا ما تؤدي إلى الكسر.
- قم بدفع الماصة في المحور X ببطء إلى PX المستهدف ، مع مراقبة SX. (من المفيد العودة أحيانا إلى الكبيبة لمعرفة ما إذا كانت قد تحولت على الإطلاق عند إدخال الماصة الدقيقة).
- عندما تكون في الموقع الصحيح، ضع المستند باستخدام z-stack.
ملاحظه: مع وجود الماصة الدقيقة في مكانها ، يمكن حقن الأدوية أو البروتينات أو متتبعات الفلورسنت ، أو قد يتم شفط السائل لتحليله لاحقا ، أو يمكن قياس الضغط أو الشحنة بالنسبة إلى قطب كهربائي آخر.
< p class = "jove_title" >
3. شفط السائل من فضاء بومان
- اضبط المضخة الدقيقة على حقن 100 نانولتر من المشبع بالفلوروديكالين لمدة 2 دقيقة لضمان سالكية الماصة وتقليل الخلط الناتج عن انسداد الماصة أثناء الدخول. أعد التصوير لضمان وضع الماصة.
- انتظر من 4 إلى 6 دقائق للحصول على ترشيح إضافي.
- اضبط المضخة الدقيقة على شفط يصل إلى 300 نانولتر بمعدل يصل إلى 50 نانولتر / دقيقة.
ملاحظه: لا يتم ملاحظة التغييرات في مورفولوجيا الكبيبات مع هذا المعدل ، مما يشير إلى أنه لا يغير معدل توصيل السائل إلى الفضاء أثناء الشفط. نظرا لعدم وجود كتلة زيت كما هو الحال في البزل الدقيق التقليدي ، فإن استعادة هذا الحجم ، الضروري لقياس الطيف الكتلي ، يمكن أن يشمل بعض البيرفلوروديكالين المحقون وربما السائل الأنبوبي. بالنسبة للمقايسات مثل قياسات الأقطاب الكهربائية الحساسة للأيونات ، والتحليل الطيفي الفلوري ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل ، وغيرها من نقاط النهاية الحساسة ، يمكن استخدام أحجام أقل. إذا لم يكن قياس الطيف الكتلي هو نقطة النهاية ، فيمكن استخدام الزيوت المعدنية وتقنيات الوخز الدقيق القياسية لقياس حجم السحب قبل التخزين.
- الصورة مرة أخرى.
- اسحب الماصة واحتفظ بالعينة، مع إضافة مخزن TRIS المؤقت وتخزينه عند -80 درجة قبل التحليل.
- القتل الرحيم للفأر باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران أو أي طريقة أخرى معتمدة.
ملاحظه: يدخل الترشيح إلى الفضاء عن طريق الترشيح من الشعيرات الدموية الكبيبية. تم الإبلاغ عن معدل الترشيح الكبيبي أحادي النيفرون (SNGFR) في الفئران بين 8-14 نانولتر / دقيقة. ومع ذلك ، تتحكم قوى الزرزور SNGFR ، وبالتالي قد يؤدي الضغط الهيدروستاتيكي السلبي في مساحة بومان إلى زيادة SNGFR. تستخدم طرق البزل الدقيق القياسية الحصار الأنبوبي بالزيت والضغط المحايد لأخذ عينات السوائل الأنبوبية ، ولكن هذه المركبات تتداخل مع قياس الطيف الكتلي (انظر أدناه) ؛ لذلك ، في هذه التقنية ، تظل النبيبات القريبة المبكرة حاصلة على براءة اختراع. علاوة على ذلك ، في وقت الشفط ، تحتوي مساحة بومان على حجم غير معروف ولكنه إيجابي من الترشيح. لذلك ، قد يتجاوز معدل شفط السوائل SNGFR.
ملاحظه: في التجارب الموضحة هنا ، كان الهدف هو الحصول على عينة أكبر من المعتاد من الترشيح الكبيبي لتحليل قياس الطيف الكتلي بواسطة تقنيات البروتين النانوي. نظرا لأن استخدام قياس الطيف الكتلي يمنع استخدام كتل الزيت بالزيت المعدني أو الشمع (مخاليط معقدة من الجزيئات العضوية التي تقلل الإشارة: الضوضاء في قياس الطيف الكتلي) ، يتم استخدام البيرفلوروديكالين لملء الماصة الدقيقة والحقنة. من غير المعروف أن Perflourodecalin يمنع التدفق الأنبوبي ولكنه خامل بيولوجيا ولا يتداخل مع قياس الطيف الكتلي.
