زراعة النمط العضوي الكلوي على CAM: تقنية لزرع مستخلصات كلى الفئران على CAM للدجاج للحث على تكوين بنية الأوعية الدموية الكلوية

الملخص

المصدر: Kaisto ، S. et al. تحسين الثقافة العضوية والعضوية الكلوية لتكوين الأوعية الدموية ، والتطوير الممتد ، وتحسين التصوير المجهري. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو طريقة لدراسة نمو الأعضاء باستخدام إعداد محسن لزرع الأعضاء على الغشاء المشيمي (CAM) من أجنة الطيور. تسمح هذه الطريقة بتطوير الأعضاء الجنينية المستنبتة بالكامل والعضيات الوعائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

< p class = "jove_title" >1. تصنيع خزانات صغيرة لزراعة الكلى الجنينية للفأر والعضيات الكلوية على CAM للدجاج وإعداد تجارب زرع الأعضاء

1. استخدم إدخالات ثقافة الخلايا عبر الويل المصممة لألواح 6 آبار أو 12 بئر.
   ملاحظه: اعتمادا على تجربة معينة ، يمكن استخدام خزانات صغيرة كبيرة أو صغيرة. من الأفضل استخدام خزانات صغيرة لتطعيم ما يصل إلى ثماني كلى جنينية أو عندما يتم وضع العديد من الخزانات الصغيرة على نفس جنين الدجاج (على سبيل المثال ، عينات التجربة والتحكم على نفس CAM للدجاج).
2. قم بقص جوانب الإدخالات باستخدام أداة دوارة متعددة بشفرة منشار دائرية أو منشار يدوي لإنشاء حلقة بلاستيكية بارتفاع 2 مم مع غشاء قابل للاختراق متصل بها.
3. قم بتلميع حواف هذه الخزانات الصغيرة بمشرط أو سكين حاد.
4. تعقيم الخزانات الصغيرة في 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة على الأقل.
5. اغسل الخزانات الصغيرة بالماء المقطر المزدوج المعقم واتركها تجف في غطاء رقائقي.
6. اشطف الخزانات الصغيرة في PBS ووسط المزرعة (DMEM عالي الجلوكوز / 10٪ FBS / 1٪ بنسلين - ستربتومايسين).
7. ضع الخزان في طبق بتري ، فوق قطرة (600 ميكرولتر / 400 ميكرولتر) من وسط الاستزراع بحيث يكون الغشاء متجها لأعلى.
8. رتب الكلى الجنينية أو العضيات الكلوية المقطعة من الجسم الحي بالتساوي على الغشاء بمساعدة ماصة أو أنبوب شعري زجاجي. تجنب ترك الكثير من السوائل حول الكلى.
9. دع العينات تلتصق بالغشاء لمدة 2-24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يمكن ترتيب ما يصل إلى ثماني كلى فأر جنينية E11.5 أو عضيات الكلى على الملحق الصغير. يوصى باستخدام الإدخال الكبير إذا تم استخدام قطع أكبر من الأنسجة الجنينية لزرع الأجانب أو خليط خلية هيدروجيل على مساحة أكبر من CAM.
10. خذ دجاجا جنينيا مستزرعا يبلغ من العمر 8 أيام محضرا وفقا للطرق المنشورة مسبقا من حاضنة زراعة الخلايا
11. انقل الخزانات الصغيرة إلى CAM بحيث تواجه الطعوم CAM ، ويغطيها الغشاء. ضع الخزانات الصغيرة في محيط CAM بحيث لا تغطي جنين الدجاج.
    ملاحظه: عند استخدام الخزانات الصغيرة الأصغر المصنوعة من إدخالات عبر البئر لألواح 12 بئرا ، يمكن وضع ما يصل إلى ثلاثة خزانات صغيرة على CAM واحد.
12. أضف 500 ميكرولتر (إدخال 6 آبار) أو 300 ميكرولتر (إدراج 12 بئر) من وسط الاستزراع إلى الخزانات الصغيرة.
13. زرع العينات على CAM الدجاج لمدة أقصاها 9 أيام. استبدل وسط الاستزراع في الخزانات الصغيرة يوميا.
    ملاحظه: يمكن ملاحظة الأوعية الدموية للعينات في أقرب وقت بعد 24-48 ساعة من الزرع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حاضنة الخلية باناسونيك 13090543 ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، 90٪ رطوبة ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة الخلية سانيو 10070347 حاضنة ثقافة الدجاج CAM. ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، 90٪ رطوبة ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون وسط النسر المعدل من Dulbecco سيغما د777 ارتفاع الجلوكوز الإيثانول (70٪) VWR مصل الأبقار الجنينية HyClone SH3007003HI الحراري العلمي ملقط دومون # 5 دومونت #5SF برنامج تلفزيوني-/- كورنينج 20-031-السيرة الذاتية برنامج تلفزيوني +/+ الغرب الحيوي X0520-500 غسل الخزانات الصغيرة. البنسلين والستربتومايسين سيغما ص 4333 إدراج ثقافة الخلايا Thincert 12 بئر مع غشاء البوليسترين 0.4 ميكرومتر غرينر بيو ون 665641 إدراج ثقافة الخلايا ذات 6 آبار رقيقة مع غشاء بوليسترين 0.4 ميكرومتر غرينر بيو ون 657610