العزل القائم على SEC للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة: تقنية لعزل الحويصلات خارج الخلية من وسائط الثقافة المكيفة للخلايا الدبقية الصغيرة

Abstract

المصدر: Lemaire, Q. et al. توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو طريقة تعتمد على كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لعزل الحويصلات خارج الخلية أو EVs المشتقة من الخلايا المناعية في الدماغ - الخلايا الدبقية الصغيرة. تعمل المركبات الكهربائية كشحنة جزيئية لتقديم وسطاء ينظمون الاستجابة المناعية. لذلك ، يمكن استخدام المركبات الكهربائية المعزولة كنموذج في المختبر لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية أثناء الاستجابة المناعية العصبية.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. الثقافة الأولية للخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم

1. الثقافة الأولية للخلايا الدبقية الصغيرة
   1. زراعة الخلايا الدبقية الأولية للفئران التجارية (2 × 10⁶ خلايا) (انظر جدول المواد) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مكمل بمصل خال من الإكسوسوم بنسبة 10٪ ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 9.0 جم / لتر جلوكوز عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. اجمع الوسط المكيف بعد ثقافة 48 ساعة وانتقل إلى عزل المركبات الكهربائية.
2. الثقافة الأولية للبلاعم
   1. استزراع البلاعم الأولية للفئران التجارية (1 × 10⁶ خلايا) في الوسط الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، مع مصل خال من الإكسوسوم.
   2. اجمع الوسط المكيف بعد ثقافة 24 ساعة وانتقل إلى عزل المركبات الكهربائية.

2. عزل المركبات

الكهربائية

1. العزل المسبق للمركبات الكهربائية عن الوسط المكيف
   1. انقل وسط الاستزراع المكيف من الخلايا الدبقية الصغيرة أو مزارع البلاعم (الخطوات 1.1.2 أو 1.2.2) إلى أنبوب مخروطي الشكل.
   2. جهاز طرد مركزي عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لحبيبات الخلايا.
   3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد. جهاز طرد مركزي عند 1,200 × جم لمدة 20 دقيقة عند RT للتخلص من الأجسام موت الخلايا المبرمج.
   4. انقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي كربونات سعة 10.4 مل وانقل الأنبوب إلى دوار 70.1 Ti. جهاز طرد مركزي فائق عند 100,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية لحبيبات المركبات الكهربائية.
   5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات المحتوية على EVs في 200 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات المصفى 0.20 ميكرومتر (PBS).
2. عزل المركبات الكهربائية
   1. إعداد عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم محلي الصنع (SEC)
      1. أفرغ عمودا كروماتوغرافيا زجاجيا (الطول: 26 سم ؛ القطر: 0.6 سم) (انظر جدول المواد) ، واغسله وعقمه.
      2. ضع مرشحا 60 ميكرومتر في أسفل العمود.
      3. قم بتكديس العمود بمصفوفة قاعدة ترشيح هلام الاغاروز المتشابكة لإنشاء مرحلة ثابتة بقطر 0.6 سم وارتفاع 20 سم.
      4. اشطف المرحلة ب 50 مل من 0.20 ميكرومتر من PBS المصفى. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا إذا لزم الأمر.
   2. ضع حبيبات EV المعلقة أعلى المرحلة الثابتة لعمود SEC.
   3. اجمع 20 كسرا متسلسلا من 250 ميكرولتر مع الاستمرار في إضافة 0.20 ميكرومتر من PBS المصفى في الجزء العلوي من المرحلة الثابتة لمنع جفاف العمود. قم بتخزين الكسور عند -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: يمكن إجراء تخزين أطول من أسبوع واحد عند -80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة EV للتحليل الجزيئي.

Materials