مقالة منهجية

استخراج البروتينات المرتبطة بالحويصلات خارج الخلية المستند إلى SDS-PAGE: إجراء لاستخراج البروتينات من المركبات الكهربائية وإعدادها للهضم داخل الهلام

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lemaire، Q. et al. توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة الهضم داخل الهلام SDS-PAGE لاستخراج البروتين من الحويصلات خارج الخلية أو EVs. بمجرد عزلها ، يمكن استخدام شظايا البروتين التي تم الحصول عليها لتحليل البروتينات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توصيف المركبات الكهربائية

  1. تحليل اللطخة الغربية
    1. استخراج البروتين
      1. اعزل المركبات الكهربائية حسب عمود الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم (SEC) وقم بالقياس الكمي باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA).
      2. امزج 50 ميكرولتر من عازلة RIPA (150 ملي كلوريد الصوديوم [NaCl] ، 50 ملي مولار تريس ، 5 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيليثير) -N ، N ، N ′ ، N ′ - حمض رباعي الأسيتيك [EGTA] ، 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين - رباعي الأسيتيك [EDTA] ، 100 ملي فلوريد الصوديوم [NaF] ، 10 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم ، 1٪ Nonidet P-40 ، 1 ملي مولار فينيل ميثان سولفونيل فلوريد [PMSF] ، 1x مثبط للبروتياز) مع عينة EV (25 ميكرولتر ناتجة عن تركيز EV على المرشح) لمدة 5 دقائق على الجليد إلى استخراج البروتينات.
      3. صوتيا لمدة 5 ثوان (السعة: 500 واط ؛ التردد: 20 كيلو هرتز) ، 3 مرات على الجليد.
      4. قم بإزالة الحطام الحويصلي عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
      5. اجمع المادة الطافية وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام طريقة فحص بروتين برادفورد.
    2. الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) والنشاف الغربي
      1. خلط مستخلصات البروتين (30 ميكروجرام) مع 5c عينة Laemmli (v / v).
      2. قم بتحميل مزيج البروتين على جل بولي أكريلاميد بنسبة 12٪.
      3. قم بترحيل البروتينات الموجودة في الجل باستخدام المخزن المؤقت TGS (25 ملي مولار Tris pH 8.5 و 192 ملي مولار جلايسين و 0.1٪ SDS) ، عند 70 فولت لمدة 15 دقيقة و 120 فولت لمدة 45 دقيقة.
      4. انقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز بنظام شبه جاف عند 230 فولت لمدة 30 دقيقة.
      5. تشبع الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع مانع مانع (0.05٪ توين 20 واط / حجم ، 5٪ حليب مجفف وزن / حجم في 0.1 M PBS ، درجة الحموضة 7.4).
      6. احتضان الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد للصدمة الحرارية البشرية 90 (HSP90) المخفف في المخزن المؤقت المانع (1: 100).
      7. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS-Tween (PBS ، 0.05٪ Tween 20 w / v) لمدة 15 دقيقة.
      8. احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في RT باستخدام الجسم المضاد الثانوي IgG المترافق بالفجل الحار الماعز وبيروكسيداز المخفف في المخزن المؤقت المانع (1: 10,000).
        ملاحظة: يتم إجراء التحكم السلبي باستخدام الجسم المضاد الثانوي وحده.
      9. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 1.1.2.7).
      10. اكشف عن الغشاء باستخدام مجموعة ركيزة النشاف الغربي المحسنة (ECL) (انظر جدول المواد).
< p class = "jove_title" >2. التحليل البروتيني

  1. استخراج البروتين والهضم داخل الهلام
    1. اعزل المركبات الكهربائية حسب عمود الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم (SEC) وقم بالقياس الكمي باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كرر الخطوة 1.1.1 لاستخراج بروتين EV.
    2. قم بإجراء هجرة البروتين في هلام التكديس لجل بولي أكريلاميد 12٪.
    3. ثبت البروتينات في الجل باستخدام Coomassie blue لمدة 20 دقيقة في RT.
    4. استئصال كل قطعة جل ملونة وقطعها إلى قطع صغيرة من 1 مم3.
    5. اغسل قطع الجل على التوالي ب 300 ميكرولتر من كل محلول: ماء فائق النقاء لمدة 15 دقيقة ، 100٪ أسيتونيتريل (ACN) لمدة 15 دقيقة ، 100 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3) لمدة 15 دقيقة ، ACN: 100 ملي مولار NH4HCO3 (1: 1 ، حجم / حجم) لمدة 15 دقيقة ، و 100٪ ACN لمدة 5 دقائق مع التحريك المستمر.
    6. تجفيف قطع الجل تماما باستخدام مكثف فراغ.
    7. قم بإجراء تقليل البروتين باستخدام 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار NH4HCO3 يحتوي على 10 ملي مولار ديثيوثريتول لمدة ساعة واحدة عند 56 درجة مئوية.
    8. قم بإجراء ألكلة البروتين مع 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار NH4HCO3 يحتوي على 50 ملي مولار يودوأسيتاميد لمدة 45 دقيقة في الظلام في RT.
    9. اغسل قطع الجل على التوالي باستخدام 300 ميكرولتر من كل محلول: 100 ملي مولار من NH4HCO3 لمدة 15 دقيقة ، ACN: 20 ملي مولار NH4HCO3 (1: 1 ، حجم / حجم) لمدة 15 دقيقة ، و 100٪ ACN لمدة 5 دقائق مع التحريك المستمر.
    10. جفف قطع الجل تماما باستخدام مكثف فراغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أسيتونيتريل فيشر للكيماويات أ 955-1 بيكربونات الأمونيوم سيجما ألدريتش 9830 الجسم المضاد HSP90 α / β (RRID: AB_675659) سانتا كروز SC-13119 مركز كاشف صبغة فحص البروتين Bio-Rad (برادفورد) بيو راد 5000006 ديثيوثريتول سيجما ألدريتش 43819 الإيثيلين جلايكول مكرر (2- أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N ′- حمض التتراأسيتيك سيجما ألدريتش 03777-10 جرام حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك سيجما ألدريتش إد-100 جرام فيشربراند Q500 Sonicator مع مسبار فيشربراند 12893543 إيدوأسيتاميد سيجما ألدريتش أولا 1149 InstantBlue Coomassie بروتين صبغ إكسبيدون ISB1L ليملي 2x بيو راد 1610737 نونيدت ب -40 فلوكا 56741 بيروكسيداز أفينيبيور مضاد للفأر IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 115-035-003 مترافق فالويدين - تتراميثيل رودامين سانتا كروز SC-362065 مثبط الإنزيم البروتيني سيجما ألدريتش S8830-20TAB كلوريد الصوديوم شارلاو SO0227 كبريتات دوديسيل الصوديوم سيجما ألدريتش L3771 فلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S7920-100G بيروفوسفات الصوديوم سيجما ألدريتش S6422-100G مكثف الفراغ SpeedVac ثيرموفيشر خلية نقل شبه جافة Trans-Blot SD بيو راد 1703940

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة