$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. التصوير داخل الحياة
ملاحظة: يعتمد الفاصل الزمني بين حقن الخلية السرطانية وجلسة التصوير داخل الحيوية الأولى على نوع خط الخلايا السرطانية المستخدم. بالنسبة للتجارب الموضحة في هذا البروتوكول ، تم حقن 1 × 105 خلايا GL261 وتصويرها بعد 10 أيام.
- تحضير التصوير
- تخدير الفأر باستخدام التخدير الاستنشاقي من خلال قناع الوجه (خليط 1.5٪ -2٪ isoflurane / O2).
- حقن الفأر تحت الجلد ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي لمنع الجفاف.
ملاحظه: للتصوير طويل الأمد ، يمكن ترطيب الفأر من خلال مضخة التسريب تحت الجلد.
- ضع الماوس ووجهه لأعلى في صندوق تصوير. استخدم صفيحة معدنية ذات فتحة قطرها 1 مم ومغناطيس صغير مدمج حول فتحة العدسة لتوفير تثبيت CIW على صندوق التصوير. أدخل الأيزوفلوران من خلال قناع الوجه وقم بالتهوية بواسطة منفذ على الجانب الآخر من الصندوق (0.8٪ -1.5٪ خليط إيزوفلوران / O2). اختياريا ، استخدم الشريط لإصلاح جسم الماوس.
ملاحظه: يمكن حقن ديكستران المسمى بالفلورسنت لتصور الأوعية الدموية أو الأصباغ الأخرى عن طريق الوريد في هذه المرحلة.
- اختياريا ، استخدم مقياس التأكسج النبضي ومسبار التسخين لمراقبة العناصر الحيوية ل mous.
ملاحظه: في هذه التجربة ، لم يكن من الضروري استخدام مقياس التأكسج النبضي ومسبار التسخين لأن الفأر كان مستقرا طوال الفترة الزمنية للتصوير (2-3 ساعات). ومع ذلك ، لأوقات التصوير الأطول ، قد تكون هناك حاجة إلى مراقبة أكثر شمولا.
- اضبط هدف الماء 25x (على سبيل المثال ، HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 مم) على أدنى موضع z وأضف قطرة كبيرة من الماء.
ملاحظه: ينصح بشدة باستخدام موزع دقيق بالغمر في الماء للتجارب طويلة المدى لأنه يسمح للعلماء بإضافة الماء أثناء التجربة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هدف جاف.
- انقل صندوق التصوير إلى المجهر المزود بغرفة مناخ مظلمة محفوظة عند 37 درجة مئوية. قم بإحضار الهدف إلى غطاء CIW حتى تلمسه قطرة الماء.
- باستخدام وضع التألق ، راقب الورم من خلال العدسة وقم بتركيز الخلايا.
2. الحصول على صورة بفاصل زمني
- حدد العديد من المواضع التي تهم الصورة وسجل إحداثياتها في البرنامج. تأكد من أن المواضع المحددة هي مواضع تمثيلية من مواقع مختلفة للورم (يمكن أن يكون كل ورم مختلفا ، ولكن لضمان الاتساق ، حدد نفس المقدار من المواضع المركزية لقلب الورم والحواف عبر جميع الفئران).
ملاحظه: يمكن إجراء فحص بلاط لجزء من الورم أو الورم المرئي بالكامل. ومع ذلك ، إذا كان الورم كبيرا ، فستزيد هذه الطريقة من الفاصل الزمني بين الصور. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تحركت الخلايا السرطانية بسرعة ، فقد يكون من الصعب تتبع نفس الخلايا بمرور الوقت.
- قم بالتبديل إلى وضع الفوتونات المتعددة وضبط الليزر على الطول الموجي الصحيح. لاحظ أنه لتجنب التلف الضوئي ، هناك حاجة إلى أطوال موجية أعلى.
ملاحظه: بالنسبة لتصوير Dendra2 ، تم استخدام طول موجي 960 نانومتر. مع الهدف المستخدم في هذه التجارب ، كان التكبير 1.3 كافيا للحصول على دقة جيدة لنوى الورم ومسح منطقة تمثيلية من الورم.
- انتقل إلى الوضع المباشر وحدد مكدس z لكل موضع من أجل الحصول على الحد الأقصى لحجم الخلايا السرطانية دون المساس بدقة الخلايا السرطانية. حدد حجم الخطوة بين الصور على أنه 3 ميكرومتر.
- استخدم الوضع ثنائي الاتجاه لزيادة سرعة المسح. يجب ألا تقل دقة دقة الصورة عن 512 × 512 بكسل.
- احصل على صور لحجم الورم في مواضع مختلفة كل 20 دقيقة لمدة ساعتين. أضف الماء إلى الهدف قبل كل الحصول على صورة.
ملاحظه: يمكن الحصول على صور اللقطات المتتابعة تلقائيا عن طريق ضبط الفاصل الزمني الصحيح في البرنامج. ومع ذلك ، يمكن أن يتحرك الماوس ، ويمكن أن يتغير الموضع أو z-stack بمرور الوقت ، مما يتسبب في فقدان البيانات. لذلك ، يوصى بإجراء الفاصل الزمني يدويا والتحقق من تحولات xyz وضبطها بين عمليات الاستحواذ.
- في هذه الخطوة ، اختياريا ، قم بتبديل علامة الفلورسنت Dendra2 بالصورة.
ملاحظه: على عكس التصوير بفاصل زمني (الذي يسمح بدراسة خصائص الخلايا السرطانية الفردية وكيف تتغير بمرور الوقت) ، سيسمح ذلك بدراسة منطقة تسلل الخلايا السرطانية في الدماغ على مدى عدة أيام.