مقايسة جذب البلاعم العابرة القائمة على التألق: طريقة في المختبر لدراسة تفاعل الورم والبلاعم من خلال الانجذاب الكيميائي الناجم عن المواد الكيميائية

الملخص

المصدر: An ، Z. et al. في المختبر الفحص لدراسة تفاعل الورم والبلاعم. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، ندرس تفاعل الورم والبلاعم باستخدام مقايسة تفاعل البلاعم عبر البلاعم القائم على التألق. يتضمن الاختبار تحليل هجرة البلاعم من خلال الانجذاب الكيميائي الناجم عن المواد الكيميائية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. في اختبار جذب البلاعم في المختبر

1. تحضير الوسائط المكيفة

1. قم بتسخين وسط صيانة الخلايا السرطانية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. رش سطح غطاء الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح 70٪ من الإيثانول على السطح باستخدام مناشف ورقية. خذ محلول انفصال الخلية من الثلاجة. رش زجاجات الوسيط ومحلول انفصال الخلية بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسح 70٪ من الإيثانول على السطح بمنشفة ورقية ، وأدخلها إلى غطاء زراعة الأنسجة.
3. أخرج الأطباق المكونة من 6 آبار من الحاضنة. قم بتحويل الماصة إلى الوسائط المكيفة بعناية في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل. ضع الأنابيب على الجليد. ماصة الوسائط في "الوسائط فقط" جيدا في أنبوب طرد مركزي معقم منفصل سعة 15 مل.
   ملاحظة: قبل هذه الخطوة ، تأكد من التحقق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا متصلة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن للمرء استخدام الألواح المطلية للسماح بتثبيت أفضل أو تضمين الخلايا العائمة في خطوة العد.
4. أضف 0.5 مل من محلول انفصال الخلايا في كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار. تحقق مما إذا كانت الخلايا السرطانية تتجمع كل دقيقة. بمجرد أن تتجمع الخلايا السرطانية لأعلى ، اضغط برفق على جانب اللوحة لمساعدة الخلايا على الانفصال.
5. ماصة 2.5 مل من وسط صيانة الخلايا السرطانية في البئر ، الماصة لأعلى ولأسفل 3 مرات لخلط الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها مع 10 ميكرولتر من محلول التربان الأزرق. الماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة العد وتحديد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الأوتوماتيكي.
6. اضبط حجم الوسائط المكيفة وفقا لرقم الخلية باستخدام وسط الخلايا الجذعية الخالية من المصل (37 درجة مئوية بين عشية وضحاها). على سبيل المثال ، إذا كان البئر A يحتوي على 3 أضعاف عدد الخلايا الحية مثل البئر الذي يحتوي على أقل عدد من الخلايا ، فقم بتخفيف الوسائط التكييف 1: 3. تستخدم هذه الخطوة للتحكم في الفرق الناجم عن معدل تكاثر الخلايا.
   ملاحظه: سبب استخدام وسط الخلايا الجذعية الخالية من المصل مع حضانة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها هو التحكم في التغيير المحتمل في الوسائط مع التعرض لفترات طويلة 37 درجة مئوية.
7. قم بتصفية الوسائط المكيفة من خلال مرشحات 0.45 ميكرومتر. ضع الوسائط المكيفة على الجليد.
   ملاحظة: تزيل هذه الخطوة الخلايا وحطام الخلايا في الوسائط المكيفة.

فئة

2. تحضير خلايا MV-4-11

1. قم بتسخين وسط IMDM (بدون FBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. رش سطح غطاء الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح 70٪ من الإيثانول على السطح باستخدام مناشف ورقية. رش الزجاجة المتوسطة بنسبة 70٪ إيثانول ، وامسح 70٪ من الإيثانول على السطح بمنشفة ورقية وأدخلها في غطاء زراعة الأنسجة.
3. خذ قارورة خلايا MV-4-11 إلى غطاء مزرعة الأنسجة. ماصة 10 مل من الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها مع 10 ميكرولتر من محلول التربان الأزرق. الماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة العد وتحديد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الأوتوماتيكي. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. أعد تعليق الخلايا في وسط IMDM (بدون FBS) لكثافة خلية نهائية تبلغ 1x10⁶ خلايا / مل.
   ملاحظة: يمكن ضبط عدد خلايا الضامة المستخدمة هنا.

< p class = "jove_title" >3. فحص Transwell

ملاحظة: في هذه الخطوة، استخدم مجموعة مقايسة ترحيل الخلايا أو قم بشراء الكواشف وإدخالها بشكل منفصل. بالنسبة لخلايا MV-4-11 ، اختر إدخالات Transwell بحجم مسام 5 ميكرومتر. للكشف عن هجرة البلاعم ، حدد مباشرة عدد البلاعم في الغرفة السفلية أو استخدم طرق القياس اللوني / الفلوريمترية. هنا ، نوضح الاختبار باستخدام طريقة القياس اللوني.

1. أحضر اللوحة المكونة من 24 بئرا والملحق والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
2. أضف 250 ميكرولتر من خلايا MV-4-11 المحضرة أعلاه في كل إدخال.
3. أضف 400 ميكرولتر من الوسط / المتوسط المكيف فقط (مع الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، تعمل هذه العينات كعنصر تحكم سلبي) إلى الغرف السفلية للوحة 24 بئرا. لكل خط ورم أو عنصر تحكم، استخدم عينات ثلاثية. تجنب الفقاعات بين الملحق والوسط المكيف. ستمنع الفقاعات البلاعم من الهجرة إلى الآبار السفلية.
4. احتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات
   ملاحظة: يمكن تعديل وقت الحضانة. يمكن رؤية الخلايا التي تهاجر إلى الغرف السفلية تحت المجهر.
5. اضغط برفق على الملحق الموجود على الجدار الداخلي لنفس البئر وتخلص من الإدراج. مع نمو خلايا MV-4-11 في معلق ، ليست هناك حاجة إلى محلول انفصال الخلايا أو علاج التربسين هنا.
قم
6. بتقطيع الخلايا في الآبار برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات لخلطها. انقل 225 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى صفيحة سوداء الجدران ذات 96 بئرا مناسبة لقياس الفلورسنت.
7. تمييع صبغة CyQuant 1:75 مع المخزن المؤقت للتحلل 4x. دوامة لفترة وجيزة وتدوير المحلول. أضف 75 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. اقرأ التألق باستخدام مجموعة مرشح 480/520 نانومتر مع قارئ لوحة مضانة.
9. تحليل البيانات عن طريق طرح الفراغ والتطبيع إلى خط خلايا الورم التحكم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 مل ماصات مصلية أوليمبوس بلاستيك 12-104 15 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة أوليمبوس بلاستيك 28-103 طرف ماصة 1 مل المنتجات الحيوية الجزيئية ART 2779-ري 2 مل ماصة شافطة صقر 357558 طبق 24 بئر ميليبور إي سي إم 507 جزء من ECM507 ، أو يمكن أن يكون
يتم شراؤها بشكل منفصل 4x تحلل المخزن المؤقت ميليبور إي سي إم 507 جزء من ECM507 ، أو يمكن أن يكون
يتم شراؤها بشكل منفصل 5 ميكرومتر إدراج Transwell ميليبور إي سي إم 507 جزء من ECM507 ، أو يمكن أن يكون
يتم شراؤها بشكل منفصل أكوتاز تقنيات الخلايا المبتكرة في -104 ب 27 جيبكو هاتف: 12587-010 صبغة CyQuant ميليبور إي سي إم 507 جزء من ECM507 ، أو يمكن أن يكون
يتم شراؤها بشكل منفصل DMEM جيبكو 11965-092 DMEM: F12 جيبكو هاتف: 10565-018 EGF بيبروتك AF-100-15 FBS جيبكو هاتف: 26140 FGF بيبروتك 100-18 ب IMDM جيبكو هاتف: 12440-053 برنامج تلفزيوني جيبكو 14190-144 القلم Strep جيبكو 15140-122 تريبان بلو بيوراد 1450021