استخراج الحويصلة خارج الخلية: تقنية لعزل الحويصلات خارج الخلية من عينات الأنسجة الكاملة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hurwitz ، S. N. et al. استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة الكاملة. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو تقنية استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة الطازجة أو المجمدة. يمكن استخدام الحويصلات المعزولة خارج الخلية لمزيد من التحليل للكشف عن أدوارها المهمة في التسبب في المرض.

البروتوكول

فئة

1. تفكك الأنسجة والطرد المركزي التفاضلي

1. تحضير 10 مل من المخزن المؤقت للتفكك (10 مجم من غراء ؛ 5.5 ملي ل-سيستين ؛ 67 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول ؛ 1.1 ملي مولار EDTA) في وسط السبات E لما يقرب من 0.4-1.0 جم من الأنسج><ة. ملاحظة: يجب تخفيف جميع المحاليل المستخدمة لتخصيب وتنقية المركبات الكهربائية في مياه مفلترة فائقة النقاء.
2. أضف أنسجة كاملة طازجة أو مجمدة إلى المخزن المؤقت للتفكك في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحتضانه في حمام ماء دافئ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. بعد الحضانة ، أضف مثبطات البروتياز والفوسفاتيز للحصول على تركيز نهائي 1x إلى مخزن التفكك الذي يحتوي على الأنسجة.
4. صب المحلول الذي يحتوي على الأنسجة في الخالط Dounce الفضفاض ، وقم بفصل الأنسجة برفق باستخدام ما يقرب من 30 ضربة بطيئة لكل عينة. يمكن تعديل عدد السكتات الدماغية بناء على تناسق الأنسجة.
5. انقل الأنسجة المنفصلة في المخزن المؤقت إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا وشظايا الأنسجة الليفية أو المتماسكة المتبقية.
6. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحبيبات والتخلص من الحطام الخلوي الكبير.
7. انقل المادة الطافية مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية إلى حبيبات حويصلات أكبر غير مرغوب فيها أو أجسام موت الخلايا المبرمج الصغيرة.
   ملاحظة: يمكن حفظ هذه الحبيبات لدراسة إضافية للحويصلات الأكبر إذا رغبت في ذلك.
8. صب المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي فائق نظيف سعة 12 مل.
   ملاحظه: قد لا يتم ترشيح عينات الأنسجة الليفية الكثيفة بسهولة. يمكن ترشيح هذه العينات من خلال مصفاة خلوية 40 ميكرومتر ، ثم تمريرها عبر إبر أصغر بشكل متسلسل (18 جم ، 20 جم ، 22 جم) قبل الترشيح من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
جهاز
9. الطرد المركزي الفائق للعينة عند 100,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية لحبيبات المركبات الكهربائية الصغيرة.
10. صب المادة الطافية واترك أنابيب الطرد المركزي الفائقة مقلوبة لمدة 5-10 دقائق ، مع النقر بشكل متكرر لإزالة السائل المتبقي على جوانب الأنابيب. يمكن أيضا شفط السائل المتبقي باستخدام ماصة مفرغة من الشفاط.
11. أعد تعليق حبيبات EV في 1.5 مل من محلول السكروز 0.25 M (10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.4). من المهم ضمان إعادة التعليق الكامل للحبيبات في هذه الخطوة. للقيام بذلك ، قم بتغطية الأنابيب بالبارافيلم قبل تدوير المركبات الكهربائية في المحلول. هز أنابيب الطرد المركزي الفائق لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل مزيج الدوامة النهائي.
12. باختصار ، قم بالطرد المركزي للأنابيب بسرعة لا تزيد عن 1,000 × جم لاستعادة التعليق السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
13. انتقل إلى خطوات تنقية التدرج أدناه ، أو إذا لزم الأمر ، قم بتخزين تعليق EV عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح 0.45 ميكرومتر VWR هاتف: 28145-505 12 مل أنابيب الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر 331372 5.5 مل أنابيب الطرد المركزي الفائق بيكمان كولتر 344057 مثبط الفوسفاتيز HALT (محلول 100x) ثيرموفيشر العلمي 78420 مثبط البروتياز HALT (محلول 100x) ثيرموفيشر العلمي 78438 السبات E المتوسطة ثيرموفيشر العلمي A1247601 MLS-50 دوار دلو متأرجح بيكمان كولتر 367280 جهاز الطرد المركزي الفائق Optima MAX-XP بيكمان كولتر 393315