تنقية المجموعات السكانية الفرعية للحويصلات خارج الخلية: تقنية لتنقية المجموعات السكانية الفرعية للحويصلات خارج الخلية باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة

الملخص

المصدر: Urwitz، S. N. et al. استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة الكاملة. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة التنقية القائمة على الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة لعزل مجموعات سكانية فرعية من الحويصلات خارج الخلية المناسبة لدراسات التوصيف.

البروتوكول

فئة

1. تنقية تدرج الكثافة

1. أضف 1.5 مل من 60٪ يوديكسانول (محلول مخزون في الماء) إلى المخزن المؤقت 1.5 مل من السكروز / تريس الذي يحتوي على EVs لإنشاء محلول نهائي يحتوي على 30٪ يوديكسانول. الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط المحلول جيدا.
   ملاحظه: كن حذرا لتجنب فقدان المحلول في طرف الماصة ، لأن تركيز اليوديكسانول العالي لزج تماما.
2. انقل محلول اليوديكسانول العازل بنسبة 30٪ الذي يحتوي على EVs إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 5.5 مل.
3. قم بإعداد ما لا يقل عن 1.5 مل من محاليل اليوديكسانول 20٪ و 10٪ لكل عينة في ماء فائق النقاء من محلول مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪.
4. قم بقياس 1.3 مل من 20٪ يوديكسانول وقم بوضع طبقة بعناية فوق طبقة التدرج السفلية باستخدام حقنة وإبرة 18 جراما. لتجنب خلط الطبقات في واجهة الكثافة ، احتفظ بشطبة الإبرة على اتصال بداخل أنبوب الطرد المركزي الفائق فوق الغضروف المفصلي مباشرة وأضف المحلول بالتنقيط.
5. طبقة 1.2 مل من محلول اليوديكسانول 10٪ فوق طبقة اليوديكسانول 20٪ باستخدام نفس التقنية المذكورة أعلاه.
6. قم بموازنة وتحميل أنابيب الطرد المركزي الفائق بعناية في جرافات الدوار وأجهزة الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح عند 268,000 × جم لمدة 50 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اضبط سرعات التسارع والتباطؤ لجهاز الطرد المركزي على الحد الأدنى من المعدلات المسموح بها لتجنب تعطيل طبقات الكثافة.
7. قم بتسمية عشرة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل لكل عينة لتتوافق مع الكسور من 1 إلى 10 من تدرجات الكثافة. يتم تعيين الكسر 1 على أنه الجزء العلوي الذي سيتم إزالته أولا ، بينما الكسر 10 هو الجزء السفلي الذي تمت إزالته آخر مرة.
8. بمجرد اكتمال الطرد المركزي الفائق المتدرج ، قم بإزالة الأنابيب برفق من جرافات الدوار وضعها في حامل ثابت. غالبا ما يتم رؤية شريط مرئي من الحويصلات في جزء الاهتمام. الماصة عشرة كسور تسلسلية من 490 ميكرولتر من أعلى التدرج إلى الأنابيب المقابلة. ستكون هناك كمية صغيرة من السوائل المتبقية في قاع الأنبوب والتي من المحتمل أن تحتوي على بروتينات ملوثة. يمكن التخلص من هذه العينة أو الاحتفاظ بها ككسر 11 ، إذا رغبت في ذلك.
9. قم بقياس معامل انكسار الكسور باستخدام مقياس الانكسار. يمكن أيضا إجراء ذلك باستخدام تشغيل تدرج تحكم بالتوازي إذا كان حفظ العينة ضروريا. الماصة 20-30 ميكرولتر من كل جزء يحتوي على اليوديكسانول على سطح مقياس الانكسار وتقدير الكثافة من خلال مقارنة مؤشرات الانكسار بكثافات اليوديكسانول المعروفة.
   ملاحظه: يمكن تخزين الكسور طوال الليل في محلول يحتوي على يوديكسانول إذا لزم الأمر قبل المتابعة إلى خطوة الغسيل التالية بالطرد المركزي الفائق.
10. انقل كل جزء إلى أنبوب طرد مركزي فائق نظيف سعة 12 مل. أضف 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي سدايوم₂HPO₄ ، 2 ملي مولار KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.4) إلى الأنبوب واخلطه عن طريق سحب العينة ببطء لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: يجب أن يكون برنامج تلفزيوني مضاف إلى العينات خاليا من الجسيمات ، ويتم ضمانه عن طريق تصفية PBS المعقم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة الغرفة لتجنب ترسيب الملح.
11. أضف 6 مل إضافية من 1x PBS إلى الأعلى واخلطها مرة أخرى بعناية.
12. الطرد المركزي الفائق للأنابيب عند 100,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية لإعادة حبيبات الحويصلات الصغيرة. صب المادة الطافية واضغط على الأنابيب حتى تجف قبل تحلل الحويصلات لتحليل البروتين أو إعادة تعليق المركبات الكهربائية للتحليل المورفولوجي.

المواد