توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs) من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMNCs): إجراء قائم على فيروس سينداي لإعادة برمجة الخلايا الجذعية العصبية المستحثة في الخلايا الجذعية العصبية المحيطية في الخلايا الجذعية العصبية المحيطية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Zheng، W. et al. توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النواة الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامينية لدراسات الزرع.J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إعادة برمجة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMNCs) إلى خلايا جذعية عصبية مستحثة (iNSCs) باستخدام فيروس سينداي. فيروس سينداي هو فيروس غير متكامل يوفر وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة الخلايا.

البروتوكول

1. إعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs بواسطة عدوى SeV

1. إعداد المحلول ووسط الثقافة
   1. تحضير محلول مخزون بولي د-ليسين (PDL) عن طريق إذابة 100 ملغ من PDL مع 100 مل من H₂O بتركيز 1 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل.
   2. تحضير محلول مخزون الأنسولين عن طريق إذابة 100 مجم من الأنسولين في 20 مل من 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك بتركيز 5 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل.
   3. لتحضير 200 مل من الوسط القاعدي iNSC ، امزج 96 مل من DMEM-F12 و 96 مل من الوسط الأساسي (جدول المواد) مع 2 مل من محلول مخزون الجلوتامين 100x ، و 2 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، و 2 مل من مكمل N2 و 2 مل من مكمل B27. أضف 10 نانوغرام / مل عامل مثبط لسرطان الدم البشري المؤتلف ، و 3 ميكرومتر CHIR99021 و 2 ميكرومتر SB431542 قبل الاستخدام. قم بتصفية الوسط وتخزينه عند 4 درجات مئوية
      ملاحظه: استخدم الوسيط في غضون أسبوعين. يضاف العامل المثبط لسرطان الدم البشري المؤتلف ، CHIR99021 SB431542 قبل الاستخدام مباشرة.
2. إعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs بواسطة عدوى SeV
   1. تعقيم مقعد نظيف بالأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات بالكحول بنسبة 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
   2. في اليوم 0 ، اجمع الخلايا في وسط MNC وانقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 1 مل من وسط MNC الدافئ مسبقا.
   3. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. أعد تعليق الخلايا بوسط MNC دافئ مسبقا (37 درجة مئوية) إلى تركيز 2 × 10⁵ خلايا لكل بئر في ألواح 24 بئرا.
   4. بعد إزالة أنابيب SeV من التخزين -80 درجة مئوية ، قم بإذابة الأنابيب التي تحتوي على SeV في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان ، ثم اتركها تذوب في RT. بمجرد إذابتها ، ضعها على الجليد على الفور.
   5. أضف SeV البشري Klf4 و Oct3/4 و SOX2 و c-MyC إلى الآبار ، بتعدد العدوى (MOI) 10. خلايا الطرد المركزي ذات الألواح عند 1,000 × جم لمدة 30 دقيقة لتسهيل ارتباط الخلايا. اترك الخلايا والمواد الطفية في اللوحات. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      تنبيه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على SeV في خزانة أمان ، ويجب معالجة جميع الأطراف والأنابيب بالإيثانول أو المبيض قبل التخلص منها.
   6. في اليوم 1 ، انقل الوسط والخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف البئر ب 1 مل من وسط MNC. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من وسط MNC الطازج الدافئ مسبقا في ألواح 24 بئرا.
      ملاحظه: استخدم لوحا منخفض المرفق 24 بئرا لمنع التصاق أي خلايا قبل الطلاء على PDL / laminin.
   7. في اليوم 2، قم بتخفيف 1 مل من 1 ملغم/مل PDL مع 19 مل من D-PBS بتركيز 50 ميكروغرام/مل. قم بتغطية ألواح 6 آبار ب 50 ميكروغرام / مل PDL لمدة ساعتين على الأقل في RT.
   8. تمييع 200 ميكرولتر من 0.5 ملغم/مل لامينين مع 20 مل من D-PBS بتركيز 5 ميكروغرام/مل. قم بشفط PDL في الألواح المكونة من 6 آبار ، وجفف على المقعد العمودي النظيف.
   9. قم بتغطية الألواح المكونة من 6 آبار ب 5 ميكروغرام / مل من اللامينين واحتضانها لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   10. في اليوم 3 ، قم بلوحة الخلايا المنقولة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.6 في وسط iNSC على ألواح 6 آبار مطلية ب PDL / laminin.
       ملاحظه: حرك الألواح برفق إذا لزم الأمر بعد وضع الخلايا على ألواح PDL / اللامينين المطلية ، محاولا عدم إزعاج ارتباط الخلايا.
   11. في اليوم 5 ، أضف 1 مل من وسط iNSC الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) في كل بئر في أطباق 6 آبار برفق.
       ملاحظه: من المتوقع أن تتعرض الخلايا لموت جذري (>60٪).
   12. في اليوم 7 ، أضف 1 مل من وسط iNSC الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) في كل بئر في أطباق 6 آبار برفق.
   13. من اليوم 9 إلى اليوم 28، استبدل الوسط المستهلك بوسيط iNSC طازج مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) كل يوم. مراقبة ظهور مستعمرات iNSC. انتقاء واستنساخ iNSC وانقلها للتوسع في حوالي 2-3 أسابيع. التقط المستعمرات ذات التشكل المناسب باستخدام ماصات زجاجية محترقة ، باستثناء أي خلايا يحتمل أن تكون ملوثة ، وشفط المستعمرات بأطراف 200 ميكرولتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 إنفيتروجين 17504044 CHIR99021 عملية الجينات 04-0004 DMEM-F12 جيبكو هاتف 11330 DMEM-F12 جيبكو هاتف 11320 لامينين روش 11243217001 مكمل N2 إنفيتروجين 17502048 NEAA إنفيتروجين 11140050 الأحماض الأمينية غير الأساسية العصبي العصبي جيبكو 10888 [م] الوسط الأساسي PDL سيجما ألدريتش P7280 بولي دي ليسين SB431542 عملية الجينات 04-0010-10 ملغ تخزين من الضوء عند -20؟ فيروس سينداي تقنيات الحياة MAN0009378 إنسولين روش 12585014 طبق 24 بئر كورنينج 3337 أنبوب مخروطي سعة 15 مل كورنينج 430052 6 آبار لوحة كورنينج 3516 المكتب الأوروبي للبراءات بيبروتك 100-64-50UG الإريثروبويتين البشري العامل المثبط لسرطان الدم البشري ميبور LIF1010 SCF المؤتلف البشري بيبروتك 300-07-100UG منتدى إدارة الإنترنت-1 بيبروتك 100-11-100UG عامل النمو الشبيه بالأنسولين البشري IL-3 بيبروتك 200-03-10UG إنترلوكين بشري 3 ديكساميثازون سيجما ألدريتش د2915-100 ملغ IMDM جيبكو هاتف: 215056-023 وسيط Dulbecco المعدل من Iscove إنسولين روش 12585014 آي تي إس إكس إنفيتروجين 51500-056 مكمل الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - X جلوتاماكس إنفيتروجين 21051024 100 × محلول مخزون الجلوتامين هامز F12 جيبكو 11765-054 1-ثيوجلسرين سيجما ألدريتش م 6145 سام للاستنشاق والتلامس مع الجلد حمض الأسكوربيك سيجما ألدريتش أ 92902 سامة مع ملامسة الجلد استبدال مصل الضربة القاضية جيبكو 10828028 وسط قاعدي خال من المصل مركز الدهون المحدد كيميائيا إنفيتروجين 11905031 ترانسفيرين أنظمة البحث والتطوير 2914-HT-100G تريبان بلو جيبكو تي 10282