$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرعاية الإنسان وتم مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلية.
1. تنقية cfDNA المنتشرة من 1 مل من البلازما
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد). يتم توفير جميع المخازن المؤقتة مع المجموعة.
- تحضير المخازن المؤقتة والكواشف
أنذر: لا تضيف المحاليل الحمضية أو المبيض مباشرة إلى نفايات تحضير العينة. يمكن أن تنتج أملاح الجوانيدين الموجودة في عازلة التحلل ، ومخزن الربط ، و Wash Buffer-1 عند دمجها مع المبيض أو الأحماض مركبات شديدة التفاعل.
- المخزن المؤقت الملزم: امزج 300 مل من مركز العازلة الملزمة مع 200 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ لعمل 500 مل من المخزن المؤقت الملزم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: يسمح المخزن المؤقت الملزم بالارتباط الأمثل للأحماض النووية المتداولة بغشاء السيليكا. 500 مل من المخزن المؤقت الملزم يكفي لمعالجة 276 أو 138 أو 92 أو 69 أو 55 عينة من 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5 مل من البلازما على التوالي وتكون مستقرة لمدة عام واحد في درجة حرارة الغرفة.
- Wash Buffer-1: امزج 19 مل من مركز Wash Buffer-1 مع 25 مل من 96-100٪ إيثانول لصنع 44 مل من Wash Buffer-1 العاملة. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: يزيل Wash Buffer-1 الملوثات المرتبطة بغشاء السيليكا. 44 مل من Wash Buffer-1 العامل يكفي لمعالجة 73 عينة من 1/2/3/4/5 مل من البلازما وهو مستقر لمدة عام واحد في درجة حرارة الغرفة.
- Wash Buffer-2: اخلطي جيدا 13 مل من مركز Wash Buffer-2 مع 30 مل من 96-100٪ إيثانول لصنع 43 مل من Wash Buffer-2 العاملة. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: يزيل Wash Buffer-2 الملوثات المرتبطة بغشاء السيليكا. 43 مل من العمل Wash Buffer-2 يكفي لمعالجة ~ 56 عينة من 1/2/3/4/5 مل من البلازما ومستقر لمدة عام واحد في درجة حرارة الغرفة.
- إلى أنبوب يحتوي على 310 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الحامل المجفف بالتجميد ، أضف 1،550 ميكرولتر من محلول Elution المؤقت ، لتحضير محلول الحمض النووي الريبي الحامل بمقدار 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر. بعد إذابة الحمض النووي الريبي الناقل تماما ، قسم المحلول إلى حصص مناسبة ، وقم بتخزينه عند -30 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية. لا تقم بتجميد هذه الحصص أكثر من 3 مرات. إلى المخزن المؤقت للتحلل ، كما هو موضح في الجدول 1 ، أضف الحمض النووي الريبي الناقل المعاد تكوينه المذاب في المخزن المؤقت Elution.
ملاحظه: نظرا لأن الحمض النووي الريبي الناقل لا يذوب مباشرة في المخزن المؤقت للتحلل ، فإنه يحتاج إلى إذابته أولا في مخزن Elution ثم في المخزن المؤقت للتحلل. أولا ، يتم تعزيز ارتباط غشاء السيليكا والأحماض النووية عندما يكون هناك عدد قليل جدا من الجزيئات المستهدفة الموجودة في العينة. ثانيا ، يتم تقليل خطر تدهور الحمض النووي الريبي بسبب وجود كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي الحامل.
- قبل البدء في العزل ، أحضر الأعمدة والعينات إلى درجة حرارة الغرفة واضبط أحجام العينة على 1 مل باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، إذا لزم الأمر. قم بتسخين 2 حمامات مائية أو كتل تسخين تحتوي على أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وأنابيب تجميع سعة 2 مل إلى 60 درجة مئوية و 56 درجة مئوية على التوالي.
- إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل ، أضف 100 ميكرولتر من البروتيناز K ، و 1 مل من البلازما ، و 0.8 مل من محلول التحلل الذي يحتوي على 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الناقل (المحضر في الخطوة 1.1.4). أغلق أنبوب الطرد المركزي بغطاء واخلط المحتويات عن طريق الدوامة النبضية لمدة 30 ثانية ، مع ضمان دوامة مرئية في الأنبوب. يعد الخلط الشامل للمحتويات أمرا مهما للتحليل الفعال.
ملاحظه: مباشرة بعد الدوامة ، انتقل إلى الخطوة 1.4 ، دون تأخير.
- احتضان المحلول عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة الغطاء ، وأضف 1.8 مل من المخزن المؤقت الملزم إلى الأنبوب ، واخلطه جيدا مع دوامة النبض لمدة 15-30 ثانية بعد وضع الغطاء.
- احتضان الخليط الناتج لمدة 5 دقائق على الجليد وأدخل عمود غشاء السيليكا في جهاز التفريغ المتصل بمضخة التفريغ. بعد ذلك ، أدخل موسع أنبوب سعة 20 مل بإحكام في العمود المفتوح لمنع تسرب العينة.
- صب الخليط المحتضن بعناية في موسع أنبوب العمود وقم بتشغيل مضخة التفريغ. بعد كل شيء ، يمر خليط المحللة بالكامل عبر الأعمدة ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ، وحرر الضغط إلى 0 ملي بار ، وقم بإزالة موسع الأنبوب والتخلص منه.
ملاحظه: لتجنب التلوث المتبادل ، يجب التخلص من موسع الأنبوب بعناية لمنع انتشاره على الأعمدة المجاورة.
- قم بإزالة العمود من جهاز التفريغ ، وأدخله في أنبوب التجميع ، وجهاز الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، لإزالة أي محللة متبقية. تجاهل التدفق.
- أضف 600 ميكرولتر من Wash Buffer-1 إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من التدفق.
- أضف 750 ميكرولتر من Wash Buffer-2 إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من التدفق.
- أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وتخلص من التدفق.
- جهاز الطرد المركزي للعمود عند 20,000 × جم لمدة 3 دقائق ، عن طريق وضعه في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل.
- قم بتجفيف مجموعة عمود الغشاء تماما عن طريق وضعها في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل مع فتح الغطاء واحتضانه عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- ضع العمود في أنبوب شطف نظيف سعة 1.5 مل. في وسط غشاء العمود ، ضع 20-150 ميكرولتر من المخزن المؤقت Elution واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق مع إغلاق الغطاء.
ملاحظه: تأكد من أن المخزن المؤقت Elution متوازن مع درجة حرارة الغرفة. في حالة استخدام المخزن المؤقت للشطف أقل من 50 ميكرولتر ، تأكد من توزيعه بعناية على مركز الغشاء. هذا يساعد في الشطف الكامل للحمض النووي المقيد. ومع ذلك ، فإن حجم الشطف غير ثابت ويمكن تغييره وفقا لتطبيقات المصب. يمكن أن يصل الشطف المستعاد إلى 5 ميكرولتر وبالتأكيد أقل من حجم الشطف المطبق على العمود.
- جهاز الطرد المركزي يتم شطفه المستعاد في جهاز طرد مركزي دقيق عند 20،000 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية الأحماض النووية ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
رقم العينة
المخزن المؤقت للتحلل (مل)
الحمض النووي الريبي الناقل في المخزن المؤقت (μL)
1
0.9
5.6
2
1.8 ب
11.3 ب
3
2.6
16.9
4
3.5
22.5
5
4.4
28.1
6
5.3
33.8 دولار
7
6.2
39.4 [إك]
8
7
45
9
7.9
50.6 دولار
10
8.8
56.3 دولار
11
9.7
61.9 دولار
12
10.6
67.5
13
11.4
73.1 دولار
14
12.3 [م]
78.8 دولار
15
13.2 [م]
84.4
16
14.1
90
17
15
95.6 دولار
18
15.8 دولار
101.3 دولار
19
16.7 [إك]
106.9
20
17.6 [إك]
112.5 دولار
21
18.5
118.1
22
19.4 [م]
123.8 دولار
23
20.2
129.4 دولار
24
21.1
135 ريال
الجدول 1. أحجام المخزن المؤقت للتحلل والحمض النووي الريبي الناقل (المذاب في المخزن المؤقت للعزوء) المطلوبة لمعالجة عينات البلازما 1 مل.