تحليل توزيع حجم الشظايا الآلي القائم على الرحلان الكهربائي الشعري ل cfDNA: طريقة قائمة على رقاقة الحمض النووي لدراسة توزيع حجم شظايا الحمض النووي المعزولة من السوائل الحيوية

الملخص

المصدر: Palande، V. et al. الكشف عن الحمض النووي الخالي من الخلايا في عينات بلازما الدم لمرضى السرطان. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نقوم بتحليل توزيع حجم الحمض النووي الخالي من الخلايا أو شظايا cfDNA باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري الآلي. تساعد هذه التقنية في اكتساب نظرة ثاقبة حول ملف تعريف شظايا الحمض النووي التي تطلقها الخلايا السرطانية أثناء موت الخلايا المبرمج.

البروتوكول

1. توزيع حجم جزء الحمض النووي ل cfDNA بواسطة محلل الشظايا

1. الخطوة قبل بدء الإجراء: موازنة تركيز صبغة الحمض النووي ومصفوفة هلام الحمض النووي مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. تحضير مزيج صبغة الجل
   ملاحظه: تعامل مع الحلول بحذر حيث من المعروف أن DMSO يسهل دخول الجزيئات العضوية إلى الأنسجة.
   1. قم بإذابة DMSO تماما عن طريق دوامة قارورة تركيز صبغة الحمض النووي لمدة 10 ثوان ، وتخرج الماصة 15 ميكرولتر من هذا المركز في قارورة مصفوفة هلام الحمض النووي وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام.
   2. مرة أخرى ، قم بدوامة القارورة المغطاة لمدة 10 ثوان حتى يتم تصور خلط الجل والصبغة.
   3. يسكب المزيج على مرشح يدور إلى الوعاء العلوي.
   4. جهاز الطرد المركزي الدقيق لمرشح الدوران عند 2،240 × جم ± 20٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. قم بتسمية صبغة الجل المحضرة في الأنبوب وتخلص من الفلتر ، وفقا للممارسات المختبرية الجيدة. قم بتسمية الأنبوب وتسجيل تاريخ التحضير.
      ملاحظه: تخلص من المرشح وفقا للممارسات المختبرية الجيدة. يمكن استخدام مزيج صبغة الجل ل ل 5 رقائق DNA عالية الحساسية (HS). إذا لم يتم استخدامه لأكثر من ساعة واحدة، فقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن التخزين في الظلام لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
3. لتحميل مزيج صبغة الهلام ، تأكد من موضع اللوحة الأساسية لمحطة تحضير الرقائق واضبط المشبك في أدنى موضع.
   1. قم بموازنة مزيج صبغة الجل مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مع مراقبة التعرض للضوء.
   2. خذ شريحة HS DNA جديدة من كيس محكم الغلق وضعها على محطة تحضير الرقائق ، ثم قم بإزالة 9.0 ميكرولتر من مزيج صبغة الجل وقم بتوزيعها في قاع بئر الرقاقة ، والتي تحمل علامة "G><". ملاحظه: ارسم مزيج صبغة الهلام ، وتجنب الجسيمات التي قد تتراكم في قاع القارورة. أثناء توزيع مزيج صبغة الهلام في شريحة الحمض النووي HS جيدا ، أدخل طرف الماصة تماما لمنع تكوين فقاعات هواء كبيرة. علاوة على ذلك ، فإن لمس الماصة عند حواف البئر سيؤدي إلى نتائج سيئة.
   3. ضع المكبس عند 1 مل وأغلق محطة تحضير الرقائق. تأكد من قفل نقرات المزلاج واضبط المؤقت على 60 ثانية ، ثم اضغط على المكبس لأسفل حتى يتم تثبيته بواسطة المشبك ، وبعد 60 ثانية بالضبط ، حرر المكبس بآلية تحرير المشبك.
   4. عندما يتراجع المكبس على الأقل إلى علامة 0.3 مل ، انتظر لمدة 5 ثوان ، ثم اسحب ببطء إلى وضع 1 مل ، ثم افتح محطة تحضير الرقاقة وقم بإزالة 9.0 ميكرولتر مرة أخرى من مزيج صبغة الهلام واستغني عنها في الجزء السفلي من بئر رقاقة الحمض النووي HS ، المميزة باسم "G".
4. لتحميل علامة الحمض النووي ، قم بتوزيع 5 ميكرولتر من علامة الحمض النووي في البئر ، مع وضع رمز السلم. كرر الإجراء لجميع بئر العينات ال 11.
5. لتحميل السلم والعينات ، قم بتوزيع 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في البئر ، المميز برمز السلم ، ثم أضف 1 ميكرولتر من العينة (الآبار المستخدمة) أو 1 ميكرولتر من العلامة (الآبار غير المستخدمة) في جميع بئر العينات ال 11.
6. قم بتدوير شريحة HS DNA لمدة 60 ثانية عند 2,400 دورة في الدقيقة عن طريق وضع الشريحة أفقيا في المحول. تأكد من عدم تلف الانتفاخ الذي يثبت شريحة HS DNA أثناء الدوامة.
7. لإدخال شريحة HS DNA في أداة محلل الشظايا ، افتح الغطاء وتأكد من إدخال خرطوشة القطب الكهربائي بشكل صحيح ، ويتم وضع محدد الرقاقة على "dsHigh Sensitivity DNA" في أداة محلل الشظايا.
8. قم بتركيب شريحة HS DNA بعناية في الوعاء ، والذي يناسب طريقة واحدة فقط ، ثم أغلق الغطاء عن طريق التأكد من أن خرطوشة القطب الكهربائي تتناسب تماما مع آبار شريحة HS DNA.
9. تشير الشاشة الموجودة على شاشة برنامج محلل الأجزاء إلى شريحة HS DNA المدرجة والغطاء المغلق من خلال رمز الشريحة في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة.
10. لبدء تشغيل شريحة HS DNA ، حدد مقايسة الحساسية العالية dsDNA من قائمة "الفحص" على شاشة الجهاز ، ثم املأ جدول أسماء العينات بشكل صحيح عن طريق تغذية المعلومات مثل أسماء العينات والتعليقات وابدأ تشغيل الشريحة بالنقر فوق الزر "ابدأ" في الجزء العلوي الأيمن من الشاشة.
11. تنظيف القطب الكهربائي بعد تشغيل شريحة HS DNA: قم بإزالة شريحة HS DNA المستخدمة على الفور بمجرد اكتمال الفحص وتخلص منها وفقا للممارسات المختبرية الجيدة. قم بتنفيذ الإجراء التالي للتأكد من نظافة الأقطاب الكهربائية ، دون بقايا من الفحص السابق.
    1. املأ ببطء 350 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات من الدرجة التحليلية في أحد آبار منظف الأقطاب الكهربائية وضع منظف القطب الكهربائي في أداة محلل الشظايا عن طريق فتح الغطاء ثم أغلق الغطاء وانتظر حوالي 10 ثوان.
    2. قم بإزالة منظف القطب عن طريق فتح الغطاء وانتظر 10 ثوان أخرى حتى يتبخر الماء الموجود على الأقطاب الكهربائية قبل إغلاق الغطاء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2100 أداة محلل حيوي شركة Agilent Technologies، Inc. G2939BA نظام 2100 Bioanalyzer هو أداة الرحلان الكهربائي الآلي الراسخة لمراقبة جودة العينة للجزيئات الحيوية. مشبك قابل للتعديل لمحطة فتيلة شركة Agilent Technologies، Inc. 5042-1398 تستخدم مع حقنة لتطبيق ضغط محدد لتحضير الرقائق. cf-DNA / cf-RNA أنابيب حافظة شركة نورجن بيوتيك 63950 يتم إغلاق أنابيب حافظة cf-DNA / cf-RNA من Norgen ، ويتم إخلاء الأنابيب البلاستيكية لجمع والحفاظ على cf-DNA ، والحمض النووي للورم المتداول ، و cf-RNA والخلايا السرطانية المنتشرة في عينات الدم البشري الكاملة أثناء التخزين والشحن محطة تحضير رقاقة شركة Agilent Technologies، Inc. 5065-4401 تستخدم لتحميل مصفوفة الجل في شريحة مع حقنة مزودة بكل مجموعة فحص - تستخدم في فحوصات الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. يتضمن محطة التحضير وساعة التوقف و 1 مشبك حقنة طقم منظف القطب الكهربائي شركة Agilent Technologies، Inc. 5065-9951 يمنع التلوث المتبادل. يزيل الملوثات البكتيرية أو البروتينية من الأقطاب الكهربائية. مرشحات لمصفوفة الجل شركة Agilent Technologies، Inc. 185-5990 تستخدم للخلط السليم لتركيز صبغة الحمض النووي ومصفوفة هلام الحمض النووي IKA Basic رقاقة دوامة شركة IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 تستخدم للخلط السليم لسلم الحمض النووي وعينة الحمض النووي على رقائق فحص المحلل الحيوي أنابيب الطرد المركزي 50 مل الإيثانول (96-100٪) كتلة تسخين أو ما شابه ذلك عند 56 درجة مئوية (قادرة على حمل أنابيب تجميع 2 مل) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ماصات (قابلة للتعديل) أطراف ماصة معقمة (يوصى باستخدام أطراف الماصة ذات حواجز الهباء الجوي للمساعدة في منع انتقال التلوث) حمام مائي أو كتلة تسخين قادرة على حمل 50 مل من أنابيب الطرد المركزي عند 60 درجة مئوية