تفاعل البوليميراز الرقمي المتسلسل: طريقة لتوليد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات النانوية للكشف عن طفرات الورم النادرة

الملخص

المصدر: Bonner و E. R. et al. الكشف عن ومراقبة الحمض النووي المنتشر المرتبط بالورم في السوائل الحيوية للمريض. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نقدم إجراء خطوة بخطوة لتوليد قطرات نانوية مستحلبة للكشف عن الأحماض النووية المستهدفة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو dPCR.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الكشف عن الحمض النووي المستهدف وقياسه باستخدام dPCR

1. قم بإعداد خليط تفاعل dPCR ل 8 آبار من أنبوب شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل بالإضافة إلى 10٪ إضافية ، عن طريق إضافة 220 ميكرولتر من مزيج التنميط الجيني الرئيسي ، و 8.8 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومتر من النوع البري والمجسات الطافرة ، و 39.6 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومتر من البادئات الأمامية والعكسية ، و 17.6 ميكرولتر من زيت تثبيت القطيرات.
2. امزج خليط تفاعل dPCR برفق عن طريق سحب الحجم الكامل لأعلى ولأسفل 10-20 مرة. لا تقم بدوامة أو جهاز طرد مركزي بعد إضافة زيت تثبيت القطرات إلى خليط التفاعل.
3. احصل على أنبوب شريطي PCR مكون من 8 آبار وقم بتوزيع 38 ميكرولتر من خليط تفاعل dPCR مباشرة في قاع كل بئر. قم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة نظيف.
   ملاحظة: يمكن أن تؤدي أنابيب شريط PCR المتشابكة أو المعبأة بإحكام معا إلى شحنات كهربائية ثابتة ، مما يتسبب في اندماج وإشارة صاخبة عند تحليل بيانات dPCR. لتجنب ذلك ، قم بتجميع الأنابيب الشريطية في أكياس منفصلة للمخاطر البيولوجية ، وتجنب الإفراط في تعبئة الأكياس ، ومنع الأنابيب من الاحتكاك ببعضها البعض.
4. أضف 12 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المضخم مسبقا إلى الآبار المناسبة لأنبوب شريط PCR. للتحكم السلبي ، أضف 12 ميكرولتر من MB H₂O.
   ملاحظة: تحليل عينات cfDNA في الآبار المتماثلة. بالنسبة للنخاعي النخاعي ، قم بالتحليل على الأقل في نسختين ، وبالنسبة للبلازما / المصل ، قم بتحليل كل عينة ثلاث نسخ.
5. قم بتحريك الحجم الكامل برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات لخلط خليط التفاعل مع عينة الحمض النووي.
6. احصل على شريحة أداة جديدة لتوليد القطيرات وماصة الحجم الكامل من الآبار 1-8 من أنبوب شريط PCR إلى القنوات المقابلة A-H في الشريحة. تجنب لمس الجزء السفلي من القنوات بطرف ماصة.
7. احصل على أنبوب شريط PCR نظيف جديد وأدخله في أداة توليد القطيرات. قم بمسح معرف شريحة أداة إنشاء القطرات ضوئيا أو إدخاله يدويا في البرنامج الموجود على كمبيوتر الجهاز. أدخل أسماء كل قناة من القنوات الثماني. انقر فوق بدء التشغيل لبدء إسقاط العينات.
8. عند اكتمال القطرات ، قم بإزالة أنبوب شريط PCR وقم بتطبيق أغطية الأنبوب الشريطي.
9. انقل أنبوب الشريط إلى جهاز تدوير حراري وقم بالتوازن مع أنبوب شريطي آخر يحتوي على 80 ميكرولتر من الماء لكل بئر.
10. قم ببرمجة ظروف التدوير الحراري على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 45 دورة من درجتي حرارتين: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ودرجة حرارة التلدين لمدة دقيقتين ؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ واستمر في 10 درجات مئوية.
    1. اضبط معدل المنحدر على 0.5 درجة مئوية / ثانية واضبط حجم العينة على 80 ميكرولتر.
11. عند اكتمال الدورة الحرارية ، قم بإزالة أنبوب الشريط ونقله إلى أداة القياس الكمي. قم بإزالة أغطية شريط PCR واستبدلها بأغطية عالية السرعة.
12. قم بتشغيل أداة القياس الكمي والكمبيوتر المتصل ببرنامج الأداة. قم بتشغيل برنامج الأداة وانقر فوق إعداد تشغيل.
13. ضع أنبوب الشريط في أداة القياس الكمي.
14. احصل على شريحة أداة قياس كمي جديدة وامسح معرف الشريحة أو أدخل معرف الشريحة يدويا في الأداة. أدخل الشريحة في الجهاز.
15. ضع الدرع المعدني أعلى الشريحة وأغلق غطاء الجهاز.
16. في برنامج الكمبيوتر، أدخل اسما لتشغيل dPCR ولكل قناة من القنوات الثماني (A-H). حدد الوضع السريع (الذي يجب استخدامه مع أغطية عالية السرعة) وانقر فوق ابدأ لبدء القياس الكمي.
17. عند اكتمال القياس الكمي ، قم بإزالة الدرع المعدني (ليتم حفظه وإعادة استخدامه) وتخلص من أنبوب شريط PCR والرقاقة. على كمبيوتر الجهاز ، سيحتوي سجل التشغيل على ملفات النتائج لكل تشغيل. استخدم ملفات .fcs لكل عينة لتحليلها باستخدام برنامج المحلل.

المواد