$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. زراعة الخلايا وإعداد السقالة
ملاحظة: يجب تحضير السقالات قبل 48 ساعة من الزرع في الفئران. يتم توفير المجلدات التالية على أساس كل سقالة. اضرب الكميات حسب الحاجة للسقالات الإضافية.
- قطع سقالات بولي (حمض اللاكتيك) (PLA) إلى قطع بحجم تجويف الاستئصال (حوالي 2 مم × 2 مم). يمكن قص السقالات يدويا باستخدام المقص أو باستخدام ثقب للتكرار.
- تعقيم عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة متبوعا بالغمر في PBS. ضع سقالة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين أثناء تحضير الخلايا للبذر.
- ارفع الخلايا الجذعية الجذعية المستنبتة باستخدام 0.05٪ تربسين (3-5 مل لقارورة T75). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تأكد من رفع الخلايا ، ثم أضف 7-10 مل DMEM إلى القارورة لتعطيل التربسين.
- انقل محتويات القارورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بيليه 5 × 105 MSCs لكل سقالة عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
- استنشط المواد الطافية وأعد تعليق الخلايا الجذعية الجذعية في 5 ميكرولتر DMEM لكل 5 × 105 خلايا.
- تحضير السقالات للبذر عن طريق تجفيفها بالتربيت.
- قم بإزالة سقالة من غمر DMEM بالملقط وضعها مؤقتا على غطاء اللوحة المكونة من 6 آبار. ارفع السقالة عن الغطاء ، تاركا وراءه قطرة من DMEM الزائدة.
- ضع السقالة مرة أخرى على الغطاء مرة أخرى في مكان جديد وجاف. كرر 3-5 مرات ، ثم ضع السقالة المجففة جزئيا في طبق جديد من 6 آبار للبذر. كرر لكل سقالة.
ملاحظه: توفر السقالة المجففة جزئيا نتائج بذر الخلايا المثلى. إذا كانت السقالة رطبة جدا ، فسوف تنزلق الخلايا من السقالة وتلتصق بلوحة البئر أدناه. إذا كانت السقالة جافة جدا ، فلن تنتشر القطرة على السقالة بأكملها ، مما يؤدي إلى ضعف التوزيع الأولي للخلايا.
- باستخدام ماصة ، امزج قارورة الخلايا الجذعية برفق لتجانس المعلق حيث قد تكون بعض الخلايا قد استقرت في القاع.
- قم بعمل ماصة ببطء 2.5 ميكرولتر من معلق MSC المختلط حديثا مباشرة على السقالة، مما يؤدي إلى تكوين قطرة صغيرة فوق الجزء العلوي من السقالة.
- أضف 300 ميكرولتر DMEM إلى حواف كل بئر. سيمنع ذلك التبخر السريع لقطرة الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالسقالة.
- باستخدام الملقط ، اقلب السقالات برفق في لوح البئر. بذرة 2.5 ميكرولتر معلق MSC مختلط حديثا (ينتج عن هذا ما مجموعه 5 × 105 خلايا مصنفة لكل سقالة). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالسقالة.
- قم بتغطية السقالات في DMEM عن طريق إضافة 2 مل إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار. ارفع السقالات برفق للسماح للوسائط بالتدفق تحتها. احتضان عند 37 درجة مئوية في هذه الحالة لمدة 48 ساعة قبل جراحة الزرع.
- افحص السقالات بعد 24 ساعة وقم بإضافة / تغيير الوسائط إذا لوحظ تبخر زائد أو وسائط متغيرة اللون بسبب عدم توازن الأس الهيدروجيني.