وضع العلامات الفلورية لخلايا الورم الدبقي: طريقة تعداء قائمة على ناقلات الفيروسات النسبية للحصول على خلايا الورم الدبقي التي تعبر عن البروتين الفلوري لتصوير الأنسجة العميقة

الملخص

المصدر: Benitez ، J. A. et al. التصوير المقطعي الجزيئي الفلوري للتصوير في الجسم الحي للطعوم الزينة للورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لخلايا الورم الدبقي الهندسية وراثيا للتعبير عن بروتين الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء أو iRFP. هذه الخلايا الدبقية الموسومة بالفلورسنت لها فائدة في تصوير الأنسجة العميقة لفهم تطور أورام الدماغ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. وضع العلامات على خلايا الورم الأرومي الدبقي باستخدام FP635 أو FP720 Construct

1. إنتاج وتنقية فيروس العدسات وفقا للبروتوكول الموضح أدناه:
   1. راقب الأطباق المصنفة في اليوم 1. عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 80-90٪ ، تكون جاهزة للتعداد.
      ملاحظة: يجب أن تظل الخلايا متسحة للخضوع لانقسامات 1-2 خلوية
   2. قم بإعداد مزيج البلازميد عن طريق نقل البلازميدات الأربعة إلى أنبوب سعة 50 مل. لتحضير طبق 12 × 15 سم ، استخدم 270 ميكروغرام من ناقل النقل ، و 176 ميكروغرام من pMDL (Gag / Pol) ، و 95 ميكروغرام من pVSVG (بروتين سكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي) و 68 ميكروغرام من pREV.
   3. تحضير 13.5 مل من 0.25M CaCl₂ (مخفف ب ddH₂O) مفلتر) وأضفه إلى مزيج البلازميد. أضف 13.5 مل 2× محلول BBS. تخلط برفق عن طريق التقليب عدة مرات وتحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22-26 درجة).
   4. أضف خليط الإرسال (ينتشر في قطرات) إلى كل طبق (2.25 مل لكل طبق). حرك الألواح برفق واحتضانها عند 3٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 37 درجة مئوية طوال الليل (16-20 ساعة).
   5. راقب الخلايا. يجب أن يصلوا إلى التقاء. إذا كانت علامة مرئية (مثل GFP) موجودة في بلازميد العدسي ، فقد يتم تقييم كفاءة التعدي بصريا. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون كفاءة التعداء >90٪.
   6. قم بإزالة الوسائط ، وأضف 15 مل من DMEM الطازج + 2٪ FBS إلى كل طبق وانقله إلى 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 37 درجة مئوية.
   7. اجمع الحصاد الأول من المادة الطافية : اجمع وتجمع المواد الطافية (12 طبقا × 15 مل / طبق = 180 مل) من الأطباق.
   8. أضف 15 مل من DMEM الطازج + 2٪ FBS إلى كل طبق. احتضن الأطباق عند 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 37 درجة مئوية طوال الليل. يجب وضع الوعاء الذي يحتوي على المادة الطافية الفيروسية في احتواء ثانوي (كيس بلاستيكي محكم الغلق) وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
   9. تركيز المستحضر الفيروسي: تركيز الجزيئات الفيروسية عن طريق الطرد المركزي الفائق. الطرد المركزي المادة الطافية عند 70,000 × جم لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. يوصى باستخدام الأنابيب المخروطية (على عكس الأنابيب القاعية المستديرة) ودوارات الجرافة المتأرجحة (على عكس الدوارات ذات الزاوية الثابتة) (ببساطة لأن هذا المزيج يجعل من السهل تحديد موقع الحبيبات غير المرئية تقريبا). نستخدم أنابيب مخروطية مع دوار Beckman SW28 (سعة ستة أنابيب) عند 19,400 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. املأ الأنابيب ب 30 مل من المادة الطافية. الحجم الإجمالي للطافية من إعداد طبق 12 × 15 سم هو 360 مل ؛ لذلك ، ستتطلب معالجة الحجم الكامل دورتين متتاليتين. قم بتحميل الأنابيب ، وقم بالدوران الأول ، واسكب المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، وأعد تحميلها بمادة طافية فيروسية جديدة وقم بإجراء الدوران الثاني.
   10. اسكب المادة الطافية واترك السائل المتبقي يجف عن طريق وضع الأنابيب المقلوبة على مناشف ورقية. قم بسحب القطرات المتبقية باستخدام شفاط لإزالة كل السوائل من الحبيبات. يجب أن تكون الحبيبات بالكاد مرئية كبقعة صغيرة شفافة.
   11. أعد تعليق الكريات الفيروسية في 100 ميكرولتر من 1× HBSS. تجنب الرغوة. اشطف الأنابيب ب 100 ميكرولتر من 1× HBSS. قم بتجميع كلا المجلدين للحصول على حجم نهائي 200 ميكرولتر.
   12. انقله إلى أنبوب ميكروفيج ذو غطاء لولبي ، ولفه في بارافيلم ودوامة بسرعة منخفضة لمدة 15-30 دقيقة. سيبدو المستحضر الفيروسي المعلق في أي مكان من الشفاف إلى اللبني قليلا.
   13. قم بمسح التعليق عن طريق الدوران لمدة 10 ثوان على جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو بغطاء لولبي جديد. اصنع 20 ميكرولتر من المادة الطافية. هذا المادة الطافية الفيروسية ذات جودة في المختبر.
2. استزراع ما يقرب من 2.0 × 10⁶ خلايا من خط خلايا الورم الدبقي البشري مع DMEM بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في طبق 15 سم ؛ أو ثقافة 2.0 × 10⁶ كرات مشتقة من مريض الورم الأرومي الدبقي البشري (GBM-PDX) مع DMEM / F12 1: 1 مع مكمل B27 بالإضافة إلى عامل نمو البشرة المؤتلف البشري (EGF ؛ 20 نانوغرام / مل) و FGF (10 نانوغرام / مل) في قارورة T75.
3. حافظ على جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، و 100٪ رطوبة نسبية.
4. فصل الخلايا.
   1. بالنسبة لخلايا الورم الدبقي: قم بإزالة المادة الطافية من الصفائح وإضافة 3-5 مل من التربسين 1X إلى خلايا الورم الدبقي.
   2. بالنسبة لمجالات GBM: اجمع الخلايا عن طريق سحب الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
      1. قم بتدوير كرات GBM عند 200 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي في درجة حرارة الغرفة.
      2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 3-5 مل من محلول انفصال الخلايا.
   3. احتضان جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
قم
5. بفصل الخلايا بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات (تأكد من اكتمال تفكك الكرات وخلايا الورم الدبقي) وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا ب 5 مل من الوسط عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات. حدد صلاحية الخلية عن طريق استبعاد التريبان الأزرق.
7. صفيحة 1.0 × 10⁶ من الخلايا المستهدفة في طبق 10 سم مع 5 مل من الوسط عن طريق سحب العينات.
8. قم بنقل الخلايا التي تحتوي على فيروس عدسي يعبر عن بروتينات الفلورسنت عند تعدد العدوى (MOI) 5 وتحتضن عند 37 درجة مئوية.
9. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط من الخلايا المنقولة ، وأضف 5 مل من الوسط الطازج ، واحتضانه لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية.
10. قم بفصل الخلايا المصابة إلى معلق أحادي الخلية باستخدام التربسين كما هو موضح أعلاه. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من محلول الفرز (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 1٪ FBS).
11. ماصة تعليق الخلية في أنابيب FACS. قم بتلطيخ الخلايا ب 1 ميكرولتر / مل من 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ثنائي هيدروكلوريد لاستبعاد الخلايا الميتة. مطلوب عناصر تحكم سلبية لإعداد بوابات مقياس التدفق الخلوي (الخلايا غير المنقولة والخلايا غير المنقولة / ملطخة ب DAPI).
12. قم بفرز الخلايا الموجبة للفلورسنت / السالبة DAPI في محلول فرز واجمع الخلايا التي تم فرزها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
13. قم بتدوير الخلايا التي تم فرزها عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 5 مل من وسط الاستزراع. بذر الخلايا المصنفة في طبق طوله 10 سم عن طريق سحب العينات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة على الأقل.
14. قم بتوسيع الخلايا التي تم فرزها عن طريق تفكيك الخلايا كما هو موضح أعلاه والطلاء في أطباق متعددة لتجارب في الجسم الحي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / ارتفاع الجلوكوز HyClone / GE SH30022.1 DMEM / F12 1: 1 جيبكو هاتف: 11320-082 FBS HyClone / GE SH30071.03 أكوتاز تقنيات الخلايا المبتكرة في -104 التربسين HyClone / GE SH30236.01 مكمل B27 جيبكو 17504044 EGF المؤتلف البشري تقنيات الخلايا الجذعية 2633 [ا] FGF المؤتلف البشري تقنيات الخلايا الجذعية 2634 DPBS كورنينج 21-031-00 أنابيب FACS صقر 352235 دابي ثيرموفيشر العلمي 62248 ص 24 إليسا كلونتك 632200 فارز الخلايا سوني SH8007 جهاز طرد مركزي فائق Optima L-80 XP بيكمان كولتر 392049 أطباق زراعة الأنسجة 100 مم أوليمبوس بلاستيك 25-202 أطباق زراعة الأنسجة 150 مم أوليمبوس بلاستيك 25-203 قوارير زراعة الأنسجة T75 كورنينج 430720 وحدة 50 مل أنابيب مخروطية كورنينج هاتف: 430290 البلازميدات: ناقل نقل الفيروسات العدسية معهد سالك للدراسات البيولوجية في مختبر فيرما ناقلات التعبئة والتغليف العدسية pMDL pRev و pVSVG ك 4975-00 maxipreps خالية من السموم الداخلية مجموعة Maxiprep الخالية من Endo Qiagen هاتف 12632 1X- HBSS إنفيتروجين 14025-092 أطباق زراعة المناديل 15 سم وحدات تصفية 0.45 ميكرومتر سعة 500 مل أنابيب الطرد المركزي الفائقة القاع المخروطي بيكمان 358126 أنابيب الطرد المركزي الفائقة القاع المستديرة بيكمان 326819 24 بئر لوحات زراعة الأنسجة مجهر الفلورسنت ماصة متعددة القنوات قارئ الألواح الدقيقة ELISA