مقايسة هجرة الخلايا الجذعية لأورام الدماغ (BTSC) لدراسات العلاج من تعاطي المخدرات: تقنية تصوير الخلايا الحية في المختبر لتحليل تأثير العلاج الدوائي على هجرة الخلايا الجذعية السرطانية

الملخص

المصدر: Restall ، I. et al. فحوصات تصوير الخلايا الحية لدراسة الورم الأرومي الدبقي ورم الدماغ وهجرة الخلايا الجذعية وغزوها. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء فحص هجرة الخلايا الجذعية لورم الدماغ لتحليل تأثير الدواء المعني على هجرة الخلايا الجذعية لورم الدماغ الحي باستخدام لوحة هجرة الانجذاب الكيميائي. يسهل تصوير الخلايا الحية تصور وقياس هجرة الخلايا أثناء الفحص.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. مقايسة هجرة الخلايا الجذعية لورم الدماغ

1. قم بزرع 200,000 خلية في قارورة T25 في 8 مل من الوسائط الكاملة قبل 1-2 أسبوع من التخطيط لإجراء مقايسة الهجرة.
   ملاحظه: سيختلف الوقت بين الطلاء وإجراء الفحص اعتمادا على معدل نمو ثقافة BTSC المستخدمة.
   1. لاختبار تأثير العلاج الدوائي على الهجرة ، قم بمعالجة الخلايا مسبقا بالمركبة المناسبة ، مثل DMSO ، والأدوية ذات الأهمية عن طريق إضافة أحجام قابلة للتطبيق من السيارة أو مخزون المخدرات مباشرة في آبار منفصلة من الوسائط التي تحتوي على الخلايا.
2. قم بإعداد لوحة هجرة الانجذاب الكيميائي (الشكل 1 أ) عن طريق طلاءها بطبقة رقيقة من الكولاجين.
   1. احسب عدد آبار صفيحة الانجذاب الكيميائي المكونة من 96 بئرا والتي ستحتاج إلى المغلفة بالكولاجين. قم بتضمين ما لا يقل عن ثلاثة آبار مكررة لكل حالة.
   2. خفف 5 ملغم/مل من مخزون الكولاجين من النوع الأول إلى 0.2 ملغم/مل في حمض الأسيتيك النقي المخفف إلى 0.14٪ في ماء مستزراع.
   3. ماصة 0.2 مجم / مل من الكولاجين لكل من آبار إدخال الغشاء وآبار الخزان السفلية المستخدمة.
      ملاحظه: تتطلب الخزانات السفلية للوحة 225 ميكرولتر وتتطلب آبار إدخال الغشاء 75 ميكرولتر من الكولاجين للحصول على طلاء مناسب.
   4. ضع لوحة الهجرة في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   5. اغسل الآبار 2x مع معقم 1x PBS. إذا لم يتم استخدام اللوحة على الفور ، فقم بشفط PBS وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قبل الاستخدام ، قم بتسخين لوحة ترحيل الانجذاب الكيميائي إلى درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير الخزان السفلي للوحة هجرة الانجذاب الكيميائي.
   1. الماصة 225 ميكرولتر من الوسائط (بدون عوامل النمو) ، مكملة بنسبة 10٪ FBS كعامل جذب كيميائي ، إلى آبار الخزان السفلية للوحة هجرة الانجذاب الكيميائي.
   2. ضع الغشاء برفق في الخزان السفلي بزاوية لتجنب تكوين فقاعات.
4. ضع الخلايا في الإدخال الغشائي للوحة هجرة الانجذاب الكيميائي.
   1. قم بتعليق BTSCs المنفصلة في الوسائط (بدون عوامل النمو) بكثافة خلية تبلغ 50,000 خلية / مل. أضف الأدوية إلى وسائل الإعلام في حالة تقييم الهجرة أثناء العلاجات الدوائية المختلفة. بالتناوب ، قم بزرع أعداد متساوية من الخلايا المعالجة مسبقا وخلايا التحكم ، مع الحفاظ على تركيز الدواء النهائي عند الطلاء.
   2. لوحة 50 ميكرولتر من BTSCs من الخطوة 1.4.1 إلى كل بئر من لوحة الهجرة في ظل ظروف المعالجة المرغوبة.
5. صورة ترحيل الانجذابات الكيميائية.
   1. ضع لوحة ترحيل الانجذاب الكيميائي في نظام التصوير الخلوي الحي واضبط برنامج التصوير الآلي للحصول على صور مجهرية للوحة كل 1-2 ساعة لمدة تصل إلى 72 ساعة. باستخدام البرامج التجارية (انظر جدول المواد) ، انقر بزر الماوس الأيمن على المخطط الزمني واضبط الفاصل الزمني للمسح على كل ساعتين لمدة 24 ساعة < / > ملاحظه: سيختلف الفاصل الزمني والوقت الإجمالي المنقضي بين مزارع BTSC المستخدمة. ابدأ بفواصل زمنية مدتها ساعتان لمدة 72 ساعة حتى اكتسبت الخبرة مع ثقافات BTSC الفردية. إذا لم يكن نظام التصوير الآلي متاحا ، فيمكن الحصول على صور من نفس مجال الرؤية يدويا باستخدام مجهر وكاميرا متصلة ببرنامج التصوير.
   2. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ، احصل على الصور للتجربة بأكملها وقم بإنشاء تعريف معالجة باستخدام برنامج التحليل الذي يميز الخلايا عن خلفية الغشاء ومسام الهجرة (الشكل 1 ب ، القناع الأحمر). باستخدام البرامج التجارية (انظر جدول المواد)، حدد تعريف معالجة جديدا وقم بتعيين إعدادات تعريف المعالجة ل BTSCs على عتبة أولية تبلغ 52، وعتبة نمو تبلغ 85، وتعديلات الحجم (بكسل) بمقدار -1، ومساحة لا تقل عن 200 ميكرومتر². قم بتطبيق تعريف المعالجة هذا على الجانب السفلي من الغشاء. قم بتعديل هذا التحليل إذا لم يميز بدقة الخلايا عن غشاء الخلفية.
   3. اجمع البيانات كمساحة سطح الخلية على الجانب السفلي من الغشاء لكل من الآبار الثلاثة المكررة ، والتي تحسب فقط الخلايا التي هاجرت عبر المسام. رسم بياني لهجرة الخلايا في ميكرومتر² (مساحة الخلايا المهاجرة) بمرور الوقت (الشكل 1C).
      ملاحظه: تأكد من أن العدد النسبي للخلايا المطلية والعد على السطح العلوي للغشاء في النقطة الزمنية الأولى متشابه (أقل من 20٪ تباين في جميع الآبار) بين جميع ظروف المعالجة لتجنب أي آثار للطلاء غير المتساوي. يمكن تنفيذ جمع البيانات باستخدام البرنامج التجاري (انظر جدول المواد) عن طريق تشغيل تعريف المعالجة الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.5.2 ، والنقر فوق المقاييس ، ثم على الرسم البياني / التصدير ، ثم على تصدير البيانات.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تصوير الخلايا الحية لهجرة BTSC. (أ) هذا مثال على لوحة هجرة الانجذاب الكيميائي المكونة من 96 بئرا المغلفة بطبقة رقيقة من النوع الأول من الكولاجين قبل إجراء مقايسة الهجرة باستخدام BTSCs. تظهر الصور أ) صفيحة بها جميع الأجزاء الثلاثة (الغطاء ، وإدراج الغشاء ، والخزان) موضوعة معا ، ب) جميع الأجزاء الثلاثة منفصلة ، ج) صورة مقربة للمنظر العلوي لإدراج الغ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفوفة Matrigel كورنينج 356230 96 أطباق بئر إيبندورف 30730119 T25 Nunc EasYFlask ثيرموفيشر 156367 فالكون أنبوب مخروطي 15 مل ثيرموفيشر 352096 لوحة Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis إيسن بيوساينس 4582 [م] نظام تحليل الخلايا الحية IncuCyte Zoom إيسن بيوساينس 4545 برنامج تحليل الخلايا الحية IncuCyte Zoom إيسن بيوساينس 2016A Rev1 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيغما د8537 ثقافة المياه الصف لونزا بيوويتاكر 17-724س مصل الأبقار الجنينية (FBS) إنفيتروجين هاتف: 12483-020 كولاجين الفئران I تريفيجن 3440-100-01 حل انفصال الخلايا Accumax تقنيات الخلايا المبتكرة AM105