مقايسة غزو الغلاف العصبي لورم الدماغ (BTSC): اختبار في المختبر لتحليل تأثير العلاج بالعقاقير على غزو BTSC من المحيط العصبي

الملخص

المصدر: Restall، I. et al. فحوصات تصوير الخلايا الحية لدراسة هجرة الخلايا الجذعية لورم الأرومي الدبقي في المخ وغزوها. J. Vis. إكسب.(2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة غزو الخلايا الجذعية لورم الدماغ في المختبر (BTSC) لتحديد تأثير العلاج الدوائي على قدرة غزو BTSCs من الغلاف العصبي عبر تقنية تصوير الخلايا الحية.

البروتوكول

فئة

1. فحص غزو الخلايا الجذعية لورم الدماغ

1. قم بزرع 200,000 خلية في 8 مل من الوسائط الكاملة في قارورة T25 قبل 1-2 أسابيع من التخطيط لإجراء فحص الغزو.
   ملاحظه: يعتمد التوقيت من الطلاء إلى إجراء الفحص على معدل انتشار ثقافة BTSC المستخدمة.
   1. بالنسبة للخلايا المعالجة مسبقا ، أضف المركب محل الاهتمام إلى القارورة بالتركيز المطلوب للدورة الزمنية المحددة مسبقا قبل أن تكون المجالات العصبية جاهزة للطلاء بالغزو.
2. انتظر حتى يصل متوسط حجم الغلاف العصبي إلى حوالي 150-200 ميكرومتر ؛ عادة ، يستغرق هذا 7-14 يوما ، اعتمادا على ثقافة BTSC المستخدم><ة. ملاحظه: من المعتاد ملاحظة توزيع أحجام الكرة في القارورة.
3. قم بتمرير القارورة واخلطها برفق مع ماصة ونقل 500 ميكرولتر من المجالات العصبية BTSC إلى أنبوب مخروطي 1.5 مل لكل حالة معالجة ؛ سيتم استخدام هذا لصفيحة ثلاثة آبار مكررة.
   ملاحظة: الخطوات 1.3.1–1.3.2 اختيارية ولكنها موصى بها لتجربة الغزو الأولى على ثقافة BTSC جديدة.
   1. لتحديد كثافة المجالات العصبية التي ستنتهي في البئر ، قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 مل كما في الخطوة 1.3. امزج المجالات العصبية برفق وانقل 100 ميكرولتر إلى صفيحة منفصلة مكونة من 96 بئرا واترك المجالات العصبية تستقر عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق.
   2. تحقق من عدد المجالات العصبية تحت المجهر للتأكد من وجود مجالات عصبية متعددة في منطقة البئر التي سيتم تصويرها دون اكتظاظها.
      ملاحظه: تتطلب المجالات العصبية الغازية مساحة كافية لتضاعف قطرها ثلاث مرات دون التفاعل مع المجالات العصبية المجاورة. يمكن تعديل عدد المجالات العصبية لكل بئر عن طريق حساب عدد المجالات العصبية لكل بئر وإضافة المزيد أو أقل من المجالات العصبية من قارورة T25 إلى الأنبوب المخروطي سعة 1.5 مل في الخطوة 1.3.
4. ضع الأنبوب المخروطي سعة 1.5 مل مع الخلايا من الخطوة 1.3 على الجليد وقم بتنفيذ الخطوات من 1.5 إلى 1.7 على الجليد.
5. دع المجالات العصبية تستقر عن طريق الجاذبية في قاع الأنبوب المخروطي سعة 1.5 مل لمدة 5 دقائق وقم بتبريد صفيحة 96 بئرا على الجليد.
6. أعد تعليق المجالات العصبية في بروتين المصفوفة خارج الخلية.
   1. قم بإعداد 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين من النوع الأول 0.4 مجم / مل على الثلج لكل حالة علاجية: أضف 459 ميكرولتر من الوسائط (بدون عوامل النمو) ، و 40 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجين 5 مجم / مل ، و 0.92 ميكرولتر من 1N هيدروكسيد الصوديوم المعقم (الجدول 1).
      ملاحظة: مطلوب 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين لكل حالة علاجية: 100 ميكرولتر لكل من الآبار الثلاثة المكررة و 200 ميكرولتر من الفائض. يجب إضافة العلاجات الدوائية هنا بالتركيز النهائي المطلوب ، مطروحا من مكون الوسائط في المحلول. يصف هذا البروتوكول استخدام النوع الأول من الكولاجين باعتباره بروتين المصفوفة خارج الخلية. ومع ذلك ، يمكن اختبار أي بروتين مصفوفة خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لثقافات BTSC التي لديها معدلات غزو أبطأ ، يمكن استكمال عوامل النمو أو FBS في وسائل الإعلام لزيادة معدل الغزو.
   2. بعد أن تستقر المجالات العصبية من الخطوة 1.5 ، استنشق أكبر قدر ممكن من الوسائط دون أن تفقد حبيبات الغلاف العصبي التي استقرت في الأسفل. أعد تعليق المجالات العصبية برفق في 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين المحضر في الخطوة 1.6.1.
7. أضف 100 ميكرولتر من خليط الكولاجين والغلاف العصبي إلى ثلاثة آبار مكررة من الصفيحة المكونة من 96 بئرا على الجليد. اسمح للمناطق العصبية بالاستقرار على الجليد لمدة 5 دقائق.
8. انقل اللوحة التي تحتوي على 96 بئرا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح ببلمرة الكولاجين.
9. استعد على الفور لتصوير اللوحة المكونة من 96 بئرا.
   1. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في صينية نظام تصوير الخلايا الحية أو على مسرح المجهر للحصول على صورة كمرجع لحجم الغلاف العصبي في وقت الطلاء ، قبل بدء الغزو.
   2. احصل على الصور كل ساعة حتى يستقر معدل الغزو ؛ عادة ، يحدث هذا في غضون 24 ساعة < / > ملاحظه: يمكن تعديل الفاصل الزمني للتصوير اعتمادا على المعدات المستخدمة. يمكن أيضا تعديل الفاصل الزمني للتصوير والوقت الإجمالي المنقضي لثقافات BTSC التي لها معدلات غزو مختلفة.
10. حدد مساحة السطح المتزايدة ل BTSCs لأنها تغزو المصفوفة بمرور الوقت.
    ملاحظه: يجب أن تكون مساحة سطح الخلايا في وقت الطلاء ، المحسوبة كمتوسط لثلاثة آبار مكررة ، متشابهة (أقل من 20٪ تباين عبر جميع الآبار) بين ظروف المعالجة المختلفة لضمان عدم تأثر الاختلافات في غزو BTSC بشدة بعدد أو حجم المجالات العصبية المطلية.
    1. بالنسبة لنظام تحليل الخلايا الحية ، استخدم هدفا 10X للحصول على الصورة واحصل على أربع صور لكل بئر للآبار الثلاثة المكررة. لتحديد مساحة سطح الخلية النسبية ، الممثلة في النسبة المئوية للتقاء البئر ، قم بإعداد تعريف معالجة يسلط الضوء على الخلايا على خلفية البئر على وجه التحديد. باستخدام البرامج التجارية (انظر جدول المواد) ، حدد تعريف معالجة جديد واضبط تعديل التجزئة على 0.8 ، والحد الأدنى للمساحة إلى 300 ميكرومتر² ، والحد الأقصى للانحراف على 0.99. قم بتعديل هذا التحليل إذا لم يميز الخلايا بدقة عن الخلفية.
       ملاحظه: في حالة استخدام طرق أخرى لتصوير غزو الغلاف العصبي بمرور الوقت ، فمن المستحسن الحصول على مجالات رؤية متعددة للآبار الثلاثة المكررة بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإن عدم تصوير نفس مجال الرؤية بالضبط في كل فاصل زمني سيزيد من الخطأ المعياري للبيانات التي تم جمعها. يمكن استخدام برامج الكمبيوتر للمساعدة في قياس مساحة سطح الخلايا الغازية في كل صورة.
    2. اجمع البيانات كمساحة سطح الخلية الإجمالية (سواء كانت نسبية أو مطلقة) لكل بئر في كل نقطة زمنية وحدد متوسط الآبار الثلاثة المتكررة. رسم بياني لغزو BTSCs عن طريق رسم مساحة الخلية المتزايدة بمرور الوقت.

تحضير محلول الكولاجين مخزون [كولاجين] (ملغ / مل) 5 نهائي [كولاجين] (ملغم / مل) 0.4 عدد الآبار المطلوبة: 5 الحجم الكلي (ميكرولتر) 500 جنيه حجم الكولاجين (ميكرولتر) 40 حجم 1N هيدروكسيد الصوديوم (ميكرولتر) 0.92 حجم الوسائط (ميكرولتر) 459 < p class = "jove_content" > الجدول 1: تحضير محلول الكولاجين 0.4 مجم / مل من النوع الأول. المدرجة هي البداية المعروفة والتركيزات النهائية المرغوبة لمحلول الكولاجين من النوع الأول. الأحجام المدرجة كافية لتقطيع المجالات العصبية إلى ثلاثة آبار مكررة ، بالإضافة إلى اثنين للفائض ، ويمكن أن تتضمن حالة علاج واحدة ، كما هو موضح بالتفصيل في خطوة البروتوكول 1.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كولاجين الفئران I تريفيجن 3440-100-01 هيدروكسيد الصوديوميوم VWR BDH3247-1 حمض الخليك ميليبور سيجما AX0073-6 96 أطباق بئر إيبندورف 30730119 T25 Nunc EasYFlask ثيرموفيشر 156367 فالكون أنبوب مخروطي 15 مل ثيرموفيشر 352096 لوحة Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis إيسن بيوساينس 4582 [م] نظام تحليل الخلايا الحية IncuCyte Zoom إيسن بيوساينس 4545 برنامج تحليل الخلايا الحية IncuCyte Zoom إيسن بيوساينس 2016A Rev1 البنسلين ، الستربتومايسين سيغما ص 4333 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيغما د8537 مصل الأبقار الجنينية (FBS) إنفيتروجين هاتف: 12483-020