الزراعة المشتركة لخلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة: تقنية لمراقبة هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية في الحصين في الفئران في المختبر

الملخص

المصدر: Guyon، J. et al. الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المزخرفة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية. J. Vis. إكسب. (2021)

يصف هذا الفيديو مقايسة الزراعة المشتركة لخلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية ذات النمط الدقيق ، والتي تحاكي غزو المسالك العصبية النخاعية من قبل الخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي أثناء هجرتها على الخلايا العصبية في المساحات المحيطة بالورم. يمكن أن يساعد هذا الاختبار في تحليل تأثيرات الأدوية الدوائية التي تمنع هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية في الورم الدبقي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد الشرائح المزخرفة

1. تحضير الركيزة للزخرفة الدقيقة
   1. عالج الأغطية الزجاجية الدائرية مقاس 18 مم عن طريق تنشيط الهواء / البلازما لمدة 5 دقائق. ضع الغطاء في غرفة مغلقة مع 100 ميكرولتر من (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان في مجفف لمدة 1 ساعة.
   2. احتضان ب 100 مجم / مل من بولي (إيثيلين جلايكول) -سكسينيميديل فاليرات (الوزن الجزيئي 5,000 (Peg- SVA)) في 10 ملي مولار كربونات عازلة ، درجة الحموضة > 8 ، لمدة 1 ساعة. اشطفها على نطاق واسع بالماء عالي النقاء وجففها تحت غطاء كيميائي.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمزيد من الاستخدام.
   3. أضف المبدئ الضوئي ، 4-بنزويل بنزويل ثلاثي ميثيل الأمونيوم كلوريد (PLPP) ، عند 14.7 مجم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظه: يمكن أيضا استخدام شكل مركز من PLPP ، وهو هلام PLPP. ينتج عن ذلك وقت إضاءة أقصر للأشعة فوق البنفسجية (UV) مطلوب لتحطيم فرشاة PEG (100 مللي جول / مم²).
2. ترسيب جل البادئ الضوئي
   1. قم بإعداد خليط من 3 ميكرولتر من هلام PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لترسيب في وسط الشريحة. ضع العينة تحت غطاء كيميائي حتى التبخر الكامل للإيثانول المطلق.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمزيد من الاستخدام.
3. زجاج الشريحة Micropatterning
   1. قم بتركيب الغطاء في غرفة Ludin وضعه على المسرح الآلي لمجهر مزود بنظام التركيز التلقائي.
   2. قم بتحميل الصور المقابلة للأنماط الدقيقة المتصورة في البرنامج. قم بتطبيق هذه المعلمات: النسخ المتماثل 4 × 4 مرات ، والتباعد بين 200 ميكرومتر ، وجرعة الأشعة فوق البنفسجية 1,000 مللي جول / مم². بعد تسلسل الإضاءة الأوتوماتيكي للأشعة فوق البنفسجية ، اشطف PLPP بعيدا بغسالات PBS متعددة.
      ملاحظه: إذا تم استخدام جل PLPP ، فقم بإزالته عن طريق الغسيل المكثف بالماء منزوع الأيونات ، وجففه في تيار من N₂ ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. احتضان مع اللامينين (50 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 30 دقيقة. اغسل على نطاق واسع باستخدام PBS.
      ملاحظة: يمكن خلط محلول فلورسنت من بروتين الفلورسنت الأخضر المنقى (GFP ، 10 ميكروغرام / مل في PBS) مع اللامينين لتصور الأنماط الدقيقة عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا العصبية وخلايا GBM للزراعة المشتركة

1. ثقافة الخلايا العصبية الحصين الجنينية للفئران
   1. قم بتشريح الحصين للفئران الجنينية (E18) ونقل الأنسجة إلى محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) / 1 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازيلين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) / محلول البنسلين والستربتومايسين في أنبوب سعة 15 مل. قم بإزالة المحلول الزائد دون تجفيف الحصين.
   2. أضف 5 مل من حمض الخليك التربسين - إيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) المكمل بالبنسلين (10،000 وحدة / مل) / الستربتومايسين (10،000 ميكروغرام / مل) و 1 ملي هيبس ، واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل 2x بمحلول HBSS / HEPES / البنسلين - الستربتومايسين ، واترك الأنسجة تبقى في هذا المحلول لمدة 2-3 دقائق.
   3. قم بفصل الأنسجة باستخدام ماصتين من مادة باستور المصقولة باللهب، عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات مع كل منديل، مع الحرص على تقليل الرغوة. عد الخلايا وتقييم جدوى تعليق الخلية. ضع الخلايا العصبية على أغطية منقوشة كما هو موضح أدناه.
      ملاحظه: معدل بقاء الخلية هو 85-90٪ بعد الاستخراج.
2. زراعة الخلايا للخلايا العصبية على أغطية منقوشة دقيقة
   1. أعد ترطيب الشرائح الزجاجية ذات النمط الدقيق باستخدام PBS واحتضان وسط ثقافة الخلايا العصبية الكامل.
   2. قم بزرع الخلايا العصبية في الحصين التي تم الحصول عليها من فئران E18 Sprague-Dawley مباشرة فوق الغطاء الزجاجي المجهري بكثافة 50,000 خلية لكل سم² في الوسط العصبي القاعدي (NBM) المخصب بمصل الحصان بنسبة 3٪. ضع الخلايا العصبية ذات النمط الدقيق في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 48 ساعة < / > ملاحظه: بعد ~ 6 ساعات ، يمكن رؤية الخلايا العصبية الأولية للحصين تلتصق بالأنماط الدقيقة لللامينين.
3. الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية البشرية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية
   1. عندما تنمو الخلايا ذات الشكل الكروي في التعليق ، قم بالطرد المركزي للتعليق لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. اغسل الكرويات ب 5 مل من PBS ، واحتضن الخلايا ب 0.5 مل من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   2. أضف 4.5 مل من NBM الكامل (مكمل بمكمل B27 ، والهيبارين ، وعامل نمو الخلايا الليفية 2 ، والبنسلين ، والستربتومايسين ، كما هو موضح سابقا) ، وعد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي.
   3. قم بزرع 1,000 جيجابايت خلية على مزرعة الخلايا العصبية الدقيقة في NBM المخصب بمصل الحصان بنسبة 3٪. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، و 95٪ رطوبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسي سيلان سيغما 440140-100 مل المجموعة الأمينية مفيدة للاقتران الحيوي ل mPEG-SVA 96 بئر لوحة مستديرة القاع سارستيدت 2582624 تستخدم لتحضير الكرويات أكوتاز جيبكو أ11105-01 يتم تخزينه عند -20 درجة مئوية (طويل الأجل) أو 4 درجات مئوية (على المدى القصير) ، إنزيم تفكك المجال ب 27 جيبكو هاتف 12587 يتم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، تذويب قبل الاستخدام عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي بيبروتك 100-18 ب يتم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، تذويب قبل الاستخدام شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة إنفيتروجين سي 10283 تستخدم في عد الخلايا أغطية مارينفيلد هاتف: 111580 ركيزة زراعة الخلية خراطيش التنظيف سيغما Z363456-6EA يستخدم لتقليل الرطوبة أثناء علاج (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان DPBS 10x بان بيوتك P04-53-500 مخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية قارورة 75 سم² صقر 10497302 HBSS سيغما H8264-500 مل الهيبارين الصوديوم سيغما H3149-100KU مخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لامينين هاتف: 114956-81-9 يعزز التصاق الخلايا العصبية قارورة 75 سم² صقر 10497302 الهيبارين الصوديوم سيغما H3149-100KU مخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية برنامج ليوناردو تحميل الأنماط الدقيقة المتصورة برنامج MetaMorph الأجهزة الجزيئية ذ.م.م غير أ برنامج أتمتة الفحص المجهري ميثيل السليلوز سيغما م 0512 مخفف في NBM للحصول على تركيز نهائي 2٪ الوسط العصبي القاعدي جيبكو هاتف: 21103-049 مخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية نيكون TiE (S فلور ، 20x / 0.75 NA) مجهر مقلوب مجهز بمرحلة آلية البنسلين - الستربتومايسين جيبكو 15140-122 مخزنة في درجة حرارة 4 درجات مئوية PLPP السنخيل يستخدم البادئ الضوئي لتحلل فرشاة PEG بولي (إيثيلين جلايكول) - سكسينيميديل فاليرات (mPEG-SVA) ليسان بيو VA-PEG-VA-5000-5G تستخدم كطلاء مضاد للقاذورات التربسين EDTA سيغما T4049-100 مل تستخدم لفصل الخلايا الملتصقة