عزل واستزراع خلايا التمويح الأولية في الدماغ: إجراء لعزل واستزراع الخلايا المحيطة من الشعيرات الدموية في دماغ الأبقار دون تلوث الخلايا البطانية

الملخص

المصدر: Hørlyck، S. et al. ثقافة الخلايا المحيطة الشعرية في الدماغ لقياسات العصارة الخلوية للكالسيوم ودراسات تصوير الكالسيوم.J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء عزل وزراعة الخلايا المحيطة من الشعيرات الدموية في دماغ الأبقار دون تلوث الخلايا البطانية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. بذر واستزراع الشعيرات الدموية البقرية

1. اليوم 0: اخلطي 0.7 مل من مرق الكولاجين الوريدي مع 6.3 مل من PBS. أضف المحلول إلى قارورة T75 واترك القارورة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) أو اتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة محلول الكولاجين من القارورة واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
3. أضف 7 مل من محلول عمل الفيبرونيكتين واترك القارورة لمدة 30 دقيقة في RT. ثم قم بإزالة محلول الفبرونيكتين وزرع الشعيرات الدموية بعد ذلك مباشرة.
4. خلال فترة الانتظار البالغة 30 دقيقة ، قم بإذابة قارورة واحدة من الشعيرات الدموية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
5. عندما يتم إذابة الشعيرات الدموية ، انقلها على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي مع 30 مل من DMEM-comp وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم و RT. قم بإزالة DMEM-comp من الأنبوب وأعد تعليق الحبيبات الشعرية في 10 مل من DMEM-comp الطازج.
6. انقل التعليق سعة 10 مل إلى قارورة T75 المطلية واترك الشعيرات الدموية تلتصق بقاع القارورة لمدة 4-6 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية عند 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: معدل نمو الخلية أعلى عند 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بدلا من ثاني أكسيد الكربون التقليدي 5٪_.
7. بعد 4-6 ساعات من الحضانة ، افحص القارورة تحت المجهر الضوئي. يجب الآن إرفاق أجزاء من الشعيرات الدموية بالجزء السفلي من القارورة (الشكل 1 ، اليوم 0).
8. قم بإعداد GM وشفط وسيط DMEN-comp بعناية شديدة من الشعيرات الدموية واستبدله ب 10 مل من GM الطازج.
9. اليوم 2: إزالة GM من الشعيرات الدموية واستبدالها ب 10 مل من GM الطازجة. يجب أن يكون النمو الخلوي من الشعيرات الدموية مرئيا تحت المجهر الضوئي في هذه المرحلة (الشكل 1 ، اليوم 2-3).

2. عزل الخلايا العموشية الأولية عن الشعيرات الدموية في دماغ الأبقار

1. اليوم 4: افحص الشعيرات الدموية تحت المجهر الضوئي.
   ملاحظه: يجب أن تكون القارورة الآن حوالي 60-70٪ ملتقية لتوفير كمية مناسبة من التموين (الشكل 1 ، اليوم 4). إذا لم يكن الأمر كذلك. استبدل GM ب 10 مل من الوسط الطازج واترك القارورة في الحاضنة ليوم آخر.
2. استنشق الوسط واغسل الخلايا برفق في PBS.
3. أضف 2 مل من Trypsin-EDTA المذاب للخلايا البطانية واترك القارورة في الحاضنة لمدة 1-3 دقائق. أخرج القارورة بشكل متكرر وراقب بالمجهر خلال هذه الفترة الزمنية. < / > ملاحظه: يجب أن تدور الخلايا البطانية وتنفصل عن القارورة. يجب أن تكون الحمشات مرئية كخلايا ذات مورفولوجيا "شبح" ولا تزال متصلة بسطح القارورة. هذه خطوة صعبة ومهمة.من الضروري إزالة معظم الخلايا البطانية لتجنب تلوث الزراعة الأحادية للخلايا العضاقية ، ولكن يمكن أن يؤدي التربسين المطول أيضا إلى فصل السبائك. يمكن أن يختلف وقت التربسين قليلا من وقت لآخر ، وبالتالي من الأهمية بمكان مراقبة القارورة بشكل متكرر باستخدام المجهر أثناء العلاج.
4. اضغط برفق على القارورة ، عندما تبدأ الخلايا البطانية في التجمع ، لفصل الخلايا البطانية المخففة.
5. لإيقاف التربسينية ، أضف 10 مل من DMEM-comp إلى القارورة. اغسل القارورة بعناية عدة مرات بالوسيط لإزالة الخلايا البطانية. استنشق تعليق الخلية البطانية من القارورة. يمكن الآن استخدام الخلايا البطانية لأغراض أخرى.
6. أضف 10 مل من DMEM-comp إلى القارورة. انظر تحت المجهر الضوئي للتأكد من أن التوحيضات لا تزال موجودة ومتصلة بالأسفل. ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة للسماح للثقافة المخصبة بالفطرات بالنمو.
   ملاحظه: من المهم مراقبة الثقافة خلال الأيام التالية. إذا كان لا يزال هناك عدد لا بأس به من الخلايا البطانية تنمو ، فيمكن إجراء علاج آخر للتربسين.
7. اسمح للزراعة الأحادية للخلايا الحفقية بالنمو مع تغيير DMEM-comp. وسط كل يومين. تحقق من نمو الخلايا تحت المجهر الضوئي (الشكل 1 ، اليوم 5-8).

النتائج

الشكل 1: زراعة الشعيرات الدموية وعزل العموش.تم عزل الشعيرات الدموية من دماغ الأبقار الطازجة وزرعها في قوارير الاستزراع في اليوم 0. تمت متابعة النمو من الشعيرات الدموية في دماغ الأبقار والعزل التالي للخلايا المحيطة على مدار أيام بمجهر ضوئي. يظهر اليوم 4 أ نمو الخلايا البطانية قبل العلاج بالتربسين لإزالة الخلايا البطانية ويظهر اليوم 4 ب البقايا مباشرة بعد العلاج. يظهر اليوم 8 أ مستوى التركيز البؤري ، ح...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش د8537 محلول ملحي مخزن بالفوسفات الكولاجين الرابع سيجما ألدريتش ج 5533 قارورة T-75 سيجما ألدريتش CLS3972 مصل الأبقار الجنينية (FBS) PAA / GE للرعاية الصحية أ 15-101 فيبرونيكتين سيجما ألدريتش F1141 التربسين EDTA سيجما ألدريتش تي 4299 مجهر ضوئي أوليمبوس أوليمبوس CK2 مجهر ضوئي عمودي مع تباين الطور DMSO سيجما ألدريتش 471267 الهيبارين سيجما ألدريتش إتش3149 حاضنة الخلية ثيرمو فيشر الطرد المركزي ثيرمو فيشر Heraeus Multifuge 3SR+ جهاز طرد مركزي قياسي كبير الحجم لتدوير الخلايا Dulbecco's النسور المعدلة المتوسطة سيجما ألدريتش د0819 البنسلين ز صوديوم / كبريتات الستربتومايسين سيجما ألدريتش P0781 الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM سيجما ألدريتش M7145