مقالة منهجية

عزل الشعيرات الدموية الدماغية عن الدماغ البشري: طريقة محسنة لاستخراج الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة الدماغ البشري

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hartz ، A. M. S. وآخرون. عزل الشعيرات الدموية الدماغية عن أنسجة المخ البشرية الطازجة. J. Vis. Exp. (2018)

يعرض هذا الفيديو عزل الشعيرات الدموية الدماغية عن أنسجة الدماغ البشري الجديد. يمكن بعد ذلك استخدام الشعيرات الدموية المعزولة لإنشاء نموذج حاجز الدم الدماغي خارج الجسم الحي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير عينة الدماغ

ملاحظة: يوضح الشكل 1A مخطط سير العمل لإجراء العزل بأكمله الموضح أدناه. يمكن أن تنبع أنسجة المخ البشري من أي جزء من القشرة ويمكن استخدامها طازجة أو مجمدة. يمكن إذابة أنسجة المخ المجمدة في درجة حرارة الغرفة (بدون مخزن مؤقت ؛ ~ 30 دقيقة لمدة 10 جم). لتحقيق نتائج قابلة للمقارنة ، يجب الحصول على أنسجة المخ من نفس منطقة الدماغ لكل تجربة. تم تحسين هذا البروتوكول للقشرة الدماغية البشرية الجديدة (فترة ما بعد الوفاة أو PMI <4 ساعات) التي لم يتم تجميدها.

  1. تحضير أنسجة المخ البشري: توثيق وزن أنسجة المخ. جميع الأرقام في البروتوكول التالي مناسبة ل 10 غرام من أنسجة المخ البشري الطازجة. ضع أنسجة المخ في طبق بتري 100 مم. قم بإزالة جميع السحايا بعناية باستخدام ملقط. استخدم مشرطا لقطع المادة البيضاء.
  2. فرم أنسجة المخ البشري: قم بتقطيع أنسجة المخ بعناية وفرمها بمشرط. يفرم لمدة 5 دقائق (قطع 2-3 مم). انقل أنسجة المخ إلى مطحنة الأنسجة Potter-Elvehjem. أضف 30 مل من المخزن المؤقت للعزل.
    ملاحظه: يصعب رؤية قطع الأنسجة المفرومة لأن أنسجة المخ تتحول إلى هريسة من خلال عملية الفرم.
< p class = "jove_title" >2. التجانس

  1. طاحونة الأنسجة Potter-Elvehjem (التخليص: 150-230 ميكرومتر): تجانس كل عينة ب 100 ضربة بسرعة الخالط 50 دورة في الدقيقة. قم بتوثيق الوقت كل 25 ضربة والوقت الإجمالي اللازم ل 100 ضربة. انظر الجدول 1 للاطلاع على بروتوكول التجانس المقترح؛ يبلغ الوقت الإجمالي لتجانس 10 جم من القشرة الأمامية البشرية حوالي 22 دقيقة. لا تقلب في الهواء لمنع الفقاعات.
  2. الخالط Dounce (التخليص: 80-130 ميكرومتر): انقل المتجانس إلى الخالط Dounce على الجليد. قم بتجانس التعليق ب 20 ضربة (~ 6 ثوان / شوط ، إجمالي ~ 2 دقيقة). تجنب الفقاعات.
< p class = "jove_title" >3. الطرد المركزي

  1. قم بتوزيع الدماغ بالتساوي في أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وتوثيق الحجم الكلي للتجانس. توزيع 50 مل من المخزن المؤقت لتدرج الكثافة في أنابيب الطرد المركزي (12.5 مل لكل أنبوب). استخدم 10 مل من عازلة العزل لشطف المدقة والمجانس وتوزيعها على أنابيب الطرد المركزي الأربعة (~ 2.5 مل لكل أنبوب).
  2. أغلق أنابيب الطرد المركزي بإحكام بأغطية. امزج الوسط المتجانس ووسط تدرج الكثافة والعازلة عن طريق هز الأنابيب بقوة. جهاز الطرد المركزي عند 5,800 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية (دوار بزاوية ثابتة) ؛ حدد سرعة تباطؤ متوسطة لإبقاء الحبيبات متصلة بالأنبوب. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 2 مل من 1٪ BSA.
فئة < ص = "jove_title" >4. الترشيح

ملاحظة: لفصل الشعيرات الدموية عن خلايا الدم الحمراء وبقايا الخلايا الأخرى ، من الضروري إجراء العديد من خطوات الترشيح.

  1. شبكة 300 ميكرومتر: بعد إعادة تعليق الحبيبات ، قم بتصفية التعليق من خلال شبكة 300 ميكرومتر. يتم ترشيح الشعيرات الدموية من خلال الشبكة ، بينما تبقى الأوعية الكبيرة وحطام الدماغ الأكبر على الشبكة. اغسل الشبكة بعناية بما يصل إلى 50 مل من 1٪ BSA. تجاهل الشبكة.
    ملاحظه: تعمل خطوة الترشيح هذه على إزالة التعليق الشعري من أي أوعية أكبر أو قطع من بقايا الدماغ.
  2. مرشح سلالة خلية 30 ميكرومتر
    ملاحظه: تفصل خطوة الترشيح هذه الشعيرات الدموية عن خلايا الدم الحمراء وبقايا الدماغ الأخرى.
    1. قم بتوزيع الترشيح الشعري من الخطوة 4.1 على مرشحات سلالة الخلية الخمسة 30 ميكرومتر (حوالي 10 مل من الترشيح الشعري لكل مرشح سلالة خلية). يتم إعاقة الشعيرات الدموية بواسطة هذا المرشح ، بينما تمر خلايا الدم الحمراء والخلايا المفردة الأخرى وبقايا الدماغ الصغيرة عبر المرشح ويتم جمعها في المرشح.
    2. اغسل كل مرشح ب 25 مل من 1٪ BSA. بعد ذلك ، اسكب جميع المرشحات فوق المرشح السادس لزيادة المحصول. اغسل كل مرشح ب 50 مل من 1٪ BSA ؛ احتفظ بمرشحات سلالة الخلية التي تحتوي على الشعيرات الدموية وتخلص من المرشح.
< p class = "jove_title" >5. مجموعة الشعيرات الدموية

  1. اقلب المرشحات رأسا على عقب واغسل الشعيرات الدموية ب 50 مل من 1٪ BSA لكل مرشح إلى أنابيب سعة 50 مل. اضغط برفق باستخدام طرف الماصة في ماصة سعة 5 مل وحركها عبر الفلتر لغسل الشعيرات الدموية في الدماغ.
  2. تأكد من غسل جميع الشعيرات الدموية في الدماغ، خاصة من حافة الفلتر. تجنب الفقاعات لأن هذا يجعل عملية الترشيح أكثر صعوبة ويزيد من فرصة فقدان الشعيرات الدموية.
< ص الفئة = "jove_title" >6. الغسيل

  1. بعد جمع الشعيرات الدموية ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات عند 1,500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية (دوار دلو متأرجح). قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في حوالي 3 مل من المخزن المؤقت للعزل. اجمع جميع الكريات المعلقة من عينة واحدة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واملأها بمخزن مؤقت للعزل. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 1,500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية واغسله مرتين أخريين.
  2. قم بتوثيق نقاء الشعيرات الدموية باستخدام مجهر (تكبير 100X) وكاميرا (الشكل 1 ب). < / > ملاحظه: عادة ما يكون عائد الشعيرات الدموية في الدماغ من 10 جم من أنسجة المخ البشري حوالي 100 مجم. يمكن الآن استخدام الشعيرات الدموية الدماغية المعزولة للتجارب أو معالجتها (على سبيل المثال ، المحللة ، وعزل الغشاء) ، أو تجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية في أنابيب التبريد لمدة لا تقل عن 6-12 شهرا (تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة).
السكتات الدماغيه الوقت 1–25 7–7.5 26–50 5–5.5 51–75 5–5.5 76–100 5–5.5 الوقت الإجمالي: 22-24 دقيقة < p class = "jove_content" >الجدول 1: بروتوكول التجانس. بروتوكول التجانس لطاحونة الأنسجة Potter-Elvehjem لتجانس 10 جم من القشرة الأمامية البشرية بسرعة تجانس تبلغ 50 دورة في الدقيقة. لاحظ أن السكتات الدماغية العديدة الأولى تتطلب وقتا إضافيا لتجانس الأنسجة المفرومة. بعد هذا التجانس الأولي ، تكون مدة كل ضربة 12 ثانية (6 ثوان للحركة الهابطة ، 6 ثوان للحركة الصعودية). وبالتالي ، بعد التجانس الأولي ، يمكن تحقيق 5 ضربات في دقيقة واحدة ، أو 25 ضربة في 5 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لعزل الشعيرات الدموية. (أ) يوضح الرسم التخطيطي الخطوات الرئيسية للإجراء لعزل الشعيرات الدموية الدماغية عن الأنسجة البشرية الطازجة. (ب) تظهر الصورة شعيرات دموية معزولة في الدماغ البشري تحت مجهر ضوئي مباشرة بعد العزل (تكبير 100 مرة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معدات الحماية الشخصية (PPE) قفازات دايموند جراب بلس لاتكس ، ميكروفليكس وسط VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 32916-636 معدات الوقاية الشخصية معاطف واقية يمكن التخلص منها VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 470146-214 معدات الوقاية الشخصية؛ نظرا لطبيعة مادة المصدر البشري ، يوصى باستخدام معطف مختبر يمكن التخلص منه درع الوجه ، يمكن التخلص منه ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 19460102 معدات الوقاية الشخصية؛ نظرا لطبيعة مادة المصدر البشري ، يوصى باستخدام درع وجه يمكن التخلص منه مواد السلامة أكياس الأوتوكلاف بدرجة حرارة عالية من Clavies 8 × 12 ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 01-815-6 ورق مقعد جاف فيرسي 18 × 20 بوصة ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 14-206-32 لتغطية مناطق العمل أنظمة حاويات VWR Sharps ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 75800-272 للمشارط المستخدمة مبيض 8.2٪ كلوركس مبيد للجراثيم 64 أونصة. مركز التوريد في المملكة المتحدة ، ليكسينغتون ، كنتاكي ، الولايات المتحدة الأمريكية 323775 المعدات ثلاجة 4 درجة مئوية ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 13-986-148 مقياس الأس الهيدروجيني Accume BASIC AB15 ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية أ ب 15 تحكم هايدولف RZR 2102 هايدولف ، قرية إلك جروف ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية 501-21024-01-3 جهاز الطرد المركزي Sorvall LEGEND XTR ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 75004521 Leica L2 مجهر تشريح شركة Leica Microsystems Inc ، بوفالو جروف إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية تستخدم لإزالة السحايا الخالط POLYTRON PT2500 Kinematica AG ، لوزيرن ، سويسرا 9158168 مقياس P-403 دنفر إنسترومنت ، بوهيميا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية 191392 التحريك القياسي الصغير ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1151050 قوارير حرارية النيتروجين السائل ديوار علمي حراري ، مانسفيلد ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية 11-670-4 ج تستخدم لتجميد الأنسجة الميزان التحليلي Voyager Pro أوهاوس ، بارسيباني ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية VP214CN ZEISS Axiovert Microcope كارل زايس ، إنك ثورنوود، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية تستخدم لفحص الشعيرات الدموية المعزولة الأدوات والأواني الزجاجية Finnpipette II ماصة 1-5 مل ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 21377823T1 اغسل الشعيرات الدموية من الفلتر ماصة Finnpipette II 100-1,000 ميكرولتر ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 21377821T1 إعادة تعليق الحبيبات في BSA بيبيت بوي إنتيجرا ، هدسون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية 739658 50 مل أنابيب فالكون 25 / رف - 500 / cs VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 21008-951 شفرات مشرط EISCO ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية S95938C لفرم أنسجة المخ بارافيلم VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 52858-000 لتغطية الدورق والقارورة الحجمية أطراف ماصة فينيتيب من المعهد الحراري العلمي 5 مل ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 21-377-304 لغسل الشعيرات الدموية من الفلتر حقنة 60 مل مع Luer-Lok ثيرمو فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية BD309653 تستخدم مع حلقة الموصل لتصفية الشعيرات الدموية مقبض مشرط # 4 أدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 10060-13 تستخدم للفرم ملقط دومون # 5 أدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 11251-10 تستخدم لإزالة السحايا مطحنة مناديل Potter-Elvehjem توماس ساينتفيك ، سويدسبورو ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية 3.43 إ +28 حجم 50 مل ، الخلوص: 150-230 ميكرومتر الخالط Dounce VWR ، رادنور بنسلفانيا الولايات المتحدة الأمريكية 62400-642 حجم 15 مل ، الخلوص: 80-130 ميكرومتر مرشحات منسوجة Spectra / Mesh (300 ميكرومتر) مختبرات الطيف ، رانشو دومينغيز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 146424 يستخدم لتصفية التعليق الشعري لإزالة أي سحايا قد يترك pluriStrainers (حجم المسام: 30 ميكرومتر) pluriSelect علوم الحياة ، لايبزيغ ، ألمانيا 43-50030-03 حلقة الموصل pluriSelect علوم الحياة ، لايبزيغ ، ألمانيا 41-50000-03 إعادة استخدام عدة مرات 1 لتر قارورة حجمية لتحضير عازل العزل 1 لتر دورق لتحضير 1٪ BSA شريط التحريك لتحضير 1٪ BSA و Ficoll® زجاجة شوت (60 مل) لتحضير Ficoll® دلو الثلج للحفاظ على كل شيء باردا طبق بتري 100 مم لفرم أنسجة المخ مكشطة خلايا زراعة الأنسجة VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 89260-222 لإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي المواد الكيميائية كسر BSA V ، A-9647 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 9647-500 جرام استعد في DPBS مع Ca2 + و Mg2 + في اليوم السابق. تجنب الفقاعات أثناء التحضير. يحفظ في الثلاجة. يقلب ببطء لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام. DPBS مع Ca2+ و Mg2+ هيكلون SH30264.خ م DPBS - جزء من المخزن المؤقت للعزل فيكول PM400 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية F4375 القياس الدقيق مهم هنا. تزن في زجاجة مع شريط التقليب. رج العبوة بقوة بعد إضافة DPBS. يحفظ في الثلاجة O / N. سيكون الجو واضحا في الصباح. يقلب برفق لمدة 10-15 دقيقة قبل الاستخدام. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام. الجلوكوز (D- (+) سكر العنب) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية جي 7528 تركيز الجلوكوز (D- (+) سكر العنب): 5 ملي مولار محلول هيدروكسيد الصوديوم القياسي سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 71474 لضبط الأس الهيدروجيني ل DPBS بيروفات الصوديوم سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية ص2256 التركيز: 1 ملي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cerebral CapillariesHuman Brain TissueDensity Gradient CentrifugationFiltration MethodBSA Supplemented BufferCapillary Isolation ProtocolBlood Brain Barrier ModelTissue HomogenizationMicroscopic AnalysisCapillary Purity Assessment

مقالات ذات صلة