التصوير بالزيموغرافية للببتيد الفلوري: تقنية معدلة للكشف عن نشاط البروتياز باستخدام ركائز الفلورية في المواد الهلامية للزيموغرام

الملخص

المصدر: Deshmukh, A. A. et al. الكشف عن نشاط البروتياز عن طريق التصوير الزيموغرافي للببتيد الفلوري. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء تصوير الزيموغرافيا ، وهي تقنية كهربائية ، لتحليل النشاط المحلل للبروتين داخل العينات البيولوجية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الرحلان الكهربائي للعينات البيولوجية في المواد الهلامية بالطباعة والزيمورافيا الببتيد

1. قم بإذابة العينات في المخزن المؤقت لعينة الزيموغرافيا التقليدية (62.5 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 6.8 ، 25٪ جلسرين ، 4٪ SDS ، 0.01٪ بروموفينول أزرق). بالنسبة لعينات الخلايا والأنسجة ، يوصى باستخدام ~ 30 ميكروغرام من إجمالي البروتين لكل بئر ، و 50-100 نانوغرام من البروتين لمعايير MMP.
2. أضف 400 مل من 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer إلى جهاز الجل. قم بتحميل ما يصل إلى 35 ميكرولتر من العينة لكل بئر. قم بتشغيل العينات عند 120 فولت عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة أو حتى تشير معايير الوزن الجزيئي إلى أن البروتياز محل الاهتمام يقع ضمن طبقة هلام حل الببتيد (التي لها لون برتقالي مرئي).
   ملاحظه: تقع معظم MMPs ومتغيراتها في نطاق 35-100 كيلو دالتون. عندما تشير معايير الوزن الجزيئي إلى أن هذه الأوزان تقع ضمن طبقة الهلام التي تحل الببتيد ، يمكن إيقاف الرحلان الكهربائي. يمكن تطبيق نفس المبدأ على فئات أخرى من البروتياز ذات الأوزان الجزيئية المعروفة. إذا كان هناك اهتمام باكتشاف البروتياز المتعدد على نطاق أكبر من الأوزان الجزيئية ، فقم بتقليل حجم طبقة الهلام القابلة للحل وزيادة حجم طبقة الهلام التي تحل الببتيد.
3. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيكي وغسل المواد الهلامية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض لطيف في المخزن المؤقت لإعادة التكوين الذي يحتوي على 2.5٪ Triton X-100 ، و 1 ميكرومتر ZnCl₂ ، و 5 ملي CaCl₂ في 50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5.
4. انقل المواد الهلامية إلى محلول عازل متطور يحتوي على 1٪ Triton X-100 و 1 ميكرومتر ZnCl₂ و 5 ملي مولار CaCl₂ في 50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 لمدة 15 دقيقة. استبدلها بمحلول عازل جديد واحتضان المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية تحت تحريض لطيف لمدة 24 ساعة ، مع التأكد من غمر المواد الهلامية بالكامل في المحلول.
5. بعد 24 ساعة ، يتم استخدام المواد الهلامية للصور باستخدام ماسح ضوئي / تصوير هلام الفلورسنت باستخدام مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مم أشرطة جل فارغة ثيرموفيشر العلمي NC2015 حل SDS بنسبة 20٪ أمبيون AM9820 3x مخزن عينة الزيموغرافيا بيو راد 1610764 طقم Azido-PEG3-Maleimide انقر فوق أدوات الكيمياء AZ107 مزود الطاقة الأساسي PowerPac بيو راد 1645050 معيار Precision Plus Protein ثنائي اللون بيو راد 161-0374 PrecisionGlide الإبر تحت الجلد فيشر ساينتيك 14-826