في توصيل الجينات القائم على التثقيب الكهربائي في الرحم: تقنية لحقن الحمض النووي البلازميد في الخلايا المخيخية الجنينية لأجنة الفئران

الملخص

المصدر: Feng W. et al. تحليل فقدان الوظيفة بوساطة كريسبر في الخلايا الحبيبية المخيخية باستخدام نقل الجينات القائم على التثقيب الكهربائي للرحم. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو توصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا العصبية المخيخية لأجنة الفئران باستخدام التثقيب الكهربائي للرحم. هذه الطريقة مفيدة لفهم وظيفة الجينات في الجسم الحي في نمو الدماغ الطبيعي والتغيرات في التعبير الجيني لخلايا الخلايا العصبية أثناء تطور الورم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. أداء في الرحم الكهربائية

1. قم بتربية الفئران التي تتراوح أعمارها بين 6 و 8 أسابيع وقم بإعداد الأدوات اللازمة للتثقيب الكهربائي في الرحم. عبر ذكور Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP مع إناث الفئران CD-1. توقيت حمل الفئران CD-1 من اليوم الذي تم فيه اكتشاف السدادة المهبلية (E0.5). يتم تزويد الأجنة بالكهرباء في اليوم E13.5.
   1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (القطر الداخلي: 0.6-0.8 مم) باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. استخدم الإعدادات التالية: P = 500 ، Heat = 560 ، Pull = 150 ، Vel = 75 ، Time = 250. قم بتسمية الطرف الشعري بالحبر الأسود للحصول على تصور أفضل أثناء الحقن. قم بقص المستدق الشعري تحت مجهر مجسم باستخدام مسطرة وملاقط إبرة حادة وقم بقص الطرف بطول حوالي 6 مم.
   2. الحفاظ على وحدة الشعيرات الدموية للحفاظ على التجربة قابلة للتكرار. قم بإنشاء حافة مشطوفة من جانب واحد أثناء التشذيب. يجب أن يكون الطرف حادا قدر الإمكان لسهولة اختراق جدار الرحم وتجنب تلف أنسجة الجنين.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم مطحنة صغيرة لضبط زاوية 35 درجة. يمكن تخزين الشعيرات الدموية في درجة حرارة الغرفة في طبق بتري مقاس 10 سم في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض.
   3. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية.
   4. امزج البلازميدات sgRNA في أجزاء متساوية مع pT2K-IRES-Luc إلى تركيز نهائي لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر لكل بلازميد وتلوين محلول البلازميد باللون الأخضر السريع (التركيز النهائي 0.05٪). قم بإعداد محلول مرق أخضر سريع بنسبة 1٪ بالماء المقطر الخالي من السموم الداخلية وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة جزيئات الصبغة من المحلول.
      ملاحظه: يعد التعداء المشترك ل pT2K IRES-Luc اختياريا ، ولكنه يسمح بتحديد القابلة للحياة المثقلة بالكهرباء بعد الولادة باستخدام التصوير الحيوي. قم بإعداد كمية كافية من مزيج البلازميد للعدد الإجمالي للفئران الحامل المراد تشغيلها. استخدم حوالي 15-20 ميكرولتر لكل فأر (~ 12 جنين). تابع الجراحة على الفور.
2. تحضير الفئران للجراحة
   1. تخدير الفئران الحامل CD-1 مع الأيزوفلوران. تحفيز التخدير في صندوق يحتوي على 3-4 فول-٪ أيزوفلوران (معدل تدفق الأكسجين: 1.5 لتر / دقيقة) والحفاظ عليه ب 2 فولد-٪ أثناء الجراحة عن طريق مخروط الأنف.
      ملاحظه: يجب ألا تستغرق الجراحة الكاملة أكثر من 30 دقيقة. تقليل عدد الأجنة المحقونة والكهربائية، إذا لزم الأمر. استخدم قفازات معقمة للجراحة.
   2. ضع الماوس على ظهره على وسادة التدفئة واضبط التخدير.
   3. حقن مسكن (ميتاميزول ، 800 مجم / كجم من وزن الجسم ، تحت الجلد (SC) ، مستودع لمدة 24 ساعة).
      ملاحظه: يمكنك استخدام مسكنات أخرى معتمدة غير ميتاميزول.
   4. ضع مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة.
   5. إصلاح الأطراف مع الشريط وتعقيم البطن مع مطهر. قم بتغطية الماوس بالشاش ، مع ترك المنطقة الجراحية فقط مكشوفة. انشر 70٪ إيثانول على منطقة الجراحة والشاش.
   6. قم بعمل شق جلدي بطول حوالي 2 سم وقم بتوسيع الفجوة برفق باستخدام مقص جراحي مستقيم. حدد موقع linea alba وقم بعمل شق ثان أصغر قليلا عبر الصفاق باستخدام مقص مناديل بطرف حاد.
   7. بلل تجويف البطن المفتوح باستخدام 1x PBS معقم مسخن مسبقا.
   8. استخرج قرون الرحم بعناية من تجويف البطن باستخدام ملقط حلقي. اسحب برفق عن طريق الإمساك بجدار الرحم فقط عند الفجوة بين أكياس صفار البيض لجنينتين متجاورتين. تجنب أي ضغط على الجنين أثناء سحبه عبر الشق. قم بتكبير الشق إذا لزم الأمر وتوخي الحذر الشديد لوضع قرون الرحم على البطن مع عدم ضغط تدفق الدم عبر الشريان الرحمي.
      ملاحظه: في بعض الحالات ، ينصح باستخراج قرن رحم واحد في كل مرة واستبداله قبل الشروع في قرن الرحم الثاني.
3. الحقن والتثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد
   1. استنشق ما يقرب من 15 ميكرولتر من محلول البلازميد الملون باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المحضرة. تجنب أي فقاعات هواء أثناء هذه العملية.
      ملاحظه: يمكن لمحلول البلازميد أن يسد الطرف بسهولة إذا كان تركيزه مرتفعا. اختبر الشعيرات الدموية عن طريق إطلاق بعض الحمض النووي قبل الحقن مباشرة.
   2. أمسك الجنين برفق باستخدام ملقط حلقي وحدد موقع منطقة الرقبة.
      ملاحظه: إذا كان الجنين في وضع يصعب حقنه ، فتخطيه واذهب إلى الجنين التالي. قد تؤدي زيادة إعادة وضع الجنين إلى زيادة فرص تلفه.
   3. اخترق ببطء بطرف الشعيرات الدموية الزجاجية المعدة مسبقا في البطين الرابع عن طريق اختراق الدماغ الخلفي الظهري ثم حقن حوالي 1 ميكرولتر من مزيج البلازميد. تأكد من أن الحمض النووي المصبوغ لا يتسرب من الدماغ ويمكن رؤيته كهيكل على شكل ماسي.
      ملاحظه: كخيار ، استخدم النظارات المكبرة بمقدار 2.5 ضعفا لتصور أفضل للبطين الرابع والأوعية الدموية المحيطة. توصيل النبضات الكهربائية مباشرة بعد الحقن لمنع انتشار محلول البلازميد إلى البطينين الآخرين.
   4. ضع نبضات كهربائية مربعة (5 نبضات ، 32 مللي فولت ، 50 مللي ثانية ، 950 مللي ثانية) باستخدام ملاقط بلاتينية تشبه الملقط (انظر جدول المواد). ضع الأقطاب الكهربائية بشكل جانبي مع القطب السالب الذي يغطي الأذن والقطب الموجب في البدائية المخيخية فوق جدار الرحم. استخدم ألواح قطب كهربائي بقطر 5 مم للتثقيب الكهربائي الفعال لأجنة E13.5.
      ملاحظه: زيادة معدل بقاء الجراء عن طريق التلاعب بأقل من 2/3^من إجمالي عدد الأجنة لكل سد. تجنب الأجنة القريبة جدا من عنق الرحم. إذا تم التلاعب بها ، فقد تسبب مضاعفات أثناء المخاض وتعرض القمامة بأكملها للخطر. إذا كانت الأقطاب الكهربائية قريبة جدا من قلب الجنين، فقد يتسبب ذلك في حدوث سكتة قلبية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شريط الأوتوكلاف كيسكر للتكنولوجيا الحيوية 150262 ساحة كهربائية بي تي إكس نظام التوافق الإلكتروني 830 مجموعة ماكسي Endofree كياجين هاتف 12362 ايثانول ميرك 107017 مرهم العين (Bepanthen) باير 81552983 أخضر سريع ميرك 104022 مرشح (0.22 ميكرومتر) ميرك F8148 ملقط مستقيم أدوات العلوم الدقيقة 91150-20 شاش (X100 ES-pads 8f 10 × 10 سم) فيشر ساينتيك 15387311 شعرية زجاجية مع خيوط ناريشيجي جي دي 1-2 وسادة التدفئة ثيرمولوكس 463265 / -67 إيزوفلوران زويتيس TU061219 ملقط الحلقة أدوات العلوم الدقيقة 11103-09 مجهر مجسمة نيكون سي بي إس مقص جراحي أدوات العلوم الدقيقة 91460-11 مقص جراحي بطرف غير حاد أدوات العلوم الدقيقة 14072-10 ملاقط مع 5 مم - أقطاب قرصية بلاتين Xceltis GmbH CUY650P5 ميتاميزول WDT خيوط خياطة حريرية غير معقمة (0.12 مم) أدوات العلوم الدقيقة 18020-50 برنامج تلفزيون (1x) تقنيات الحياة 14190169 مقص مناديل بلانت (11.5 سم) أدوات العلوم الدقيقة 14072-10 pCAG-EGxxFP أدجين 50716 ريال بلازميد pX330 أدجين 42230