تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير الفئران والجراحة
ملاحظة: يتم استخدام الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 8 أسابيع في هذه الدراسة. تتبع شروط الجراحة قواعد IACUC لمؤسستنا. يتم تعقيم الأدوات ، وتطهير سطح العمل الجراحي ، وتطهير ، ويرتدي الجراح قفازات معقمة.
- في اليوم السابق للجراحة ، قم بتخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران ثم قم بإزالة الفراء على طول عظم الفخذ على الجانب الظهري إما بشفرة حلاقة رفيعة أو عامل كيميائي لإزالة الشعر.
- في يوم الجراحة ، قم بتخدير الفئران باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران في غرفة الحث. تأكد من التخدير عن طريق تحفيز قرصة إصبع القدم وعدم الاستجابة.
- ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف تحت التخدير.
- ضع الفأر المخدر على جانبه البطني ، وقم بتأمين كل طرف برفق بشريط مضاد للحساسية لخلق توتر خفيف في الطرف المراد حقنه. يتم الحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلوران الذي يتم توصيله عبر مبخر دقيق ومخروط أنف.
- تنظيف موقع الحقن مع البيتادين, ثم مرة أخرى مع 70٪ الكحول. كرر هذه العملية مرتين أخريين. تأكد من عدم وجود شعر مترهل في المجال الجراحي.
- قم بعمل شق 1 سم بمقص صغير حوالي 2 مم أسفل ومواز عظم الفخذ. اسحب الجلد بالملقط بشكل جانبي لكشف العضلات تحتها.
- يمتد العصب الوركي بعمق إلى عضلات الألوية الكبيرة والعضلة ذات الرأسين الفخذية. افصل هاتين العضلتين على طول مستوى اللفافة بمقص صغير وكشف العصب الوركي تحتها. حرر العصب من العضلات المحيطة باستخدام تشريح حاد.
- اسحب 3 ميكرولتر من الخلايا السرطانية (حوالي 50,000 خلية) من الحبيبات إلى حقنة سعة 10 ميكرولتر.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، ارسم 3 ميكرولتر من PBS كعنصر تحكم.
- ضع ملعقة معدنية صغيرة أسفل العصب عند نقطة الحقن للحصول على الدعم. تحت التصور باستخدام مجهر تشريح ، أدخل الإبرة في العصب مقابل القاعدة المعدنية ، مع الحفاظ على الإبرة موازية للعصب قدر الإمكان عند الإدخال. احرص على عدم ثقب الجزء الخلفي من العصب. قلل من التعامل مع العصب قدر الإمكان خلال هذه العملية.
- حقن ببطء في العصب أكثر من 5 ثوان. يشير تكوين لمبة في منطقة الحقن إلى حقنة جيدة. ثم اترك الإبرة في مكانها لمدة 3 ثوان قبل إزالة الإبرة برفق. يؤدي الحفاظ على الإبرة في مكانها لمدة 3 ثوان إلى تقليل التدفق العكسي للخلايا خارج العصب.
ملاحظه: يمكن إجراء الحقن باتجاه العصب البعيد أو الحبل الشوكي. من المهم أن تظل متسقا في مجموعة من التجارب. إذا انسكبت الخلايا إلى الخارج ، فلا ينبغي إدراج في تحليل التجربة. مع الخبرة ، هذه الأحداث نادرة جدا.
- أعد العصب إلى موضعه الأصلي. قم بتغطية العصب بالعضلات العلوية. عالج الفئران بتسكين مناسب ، ثم أغلق الجلد بخيوط 5-0 من النايلون.
- ضع الفأر بمفرده في قفص نظيف للمراقبة أثناء التعافي ، حتى يستيقظ تماما من التخدير. < / >
ملاحظه: يستغرق من 5 إلى 15 دقيقة لاستعادة وعيه الكامل. لا يترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا يتم إرجاع إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما. بعد ذلك ، قم بتقييم التعافي مرة واحدة على الأقل كل 24 ساعة لمدة 72 ساعة.
