زرع تقويم العظام طويل الأمد للخلايا السرطانية في أجنة الزرد: طريقة فعالة لتوصيل الخلايا السرطانية إلى البطين الرابع من أجنة الزرد لتحليل طويل الأمد لسلوك الخلايا السرطانية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Casey ، M. J. et al. زرع أورام دماغ الأطفال في أسماك الزرد في مضيفين مؤهلين مناعة لدراسة طويلة الأمد لسلوك الخلايا السرطانية والاستجابة للأدوية.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو عملية زرع تقويم العظام لخلايا ورم دماغ الزرد في البطين الرابع لجنين الزرد المؤهل للمناعة. يسمح هذا الإجراء بدراسة طويلة الأمد لغزو الخلايا السرطانية وسلوكها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. حقن تعليق الورم في البطين الرابع لجنين 2-dpf

1. نقل 10-20 أجنة مخدرة منزوعة التكلل إلى محيط صفيحة الحقن باستخدام ماصة نقل ؛ يجب أن تسقط الأجنة بشكل جانبي على لوحة الحقن ، بحيث يكون البطينان مرئيين بوضوح ويمكن الوصول إليهما. استخدم مسبارا بزاوية لضبط الأجنة حسب الحاجة ووضعها بعيدا عن الحافة الخارجية للوحة الحقن.
2. قم بتحميل 1-2 ميكرولتر من تعليق الخلية السرطانية في إبرة الحقن باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام وأدخل الإبرة في المعالج.
3. قم بخفض المناور يدويا ، مع إمساك الإبرة بزاوية 45 درجة. اضبط المقابض الموجودة على المعالج الدقيق في اتجاهات x و y و z حتى تصبح الإبرة أعلى بقليل وحوالي 5 مم إلى يمين رأس الجنين. انظر من خلال عدسات المجهر المجسم واضبط المعالج الدقيق ببطء في الاتجاه x حتى تخترق الإبرة البطين الرابع للجنين. لا تدع الإبرة تخترق القلب أو صفار البيض.
   1. ادفع دواسة القدم المتصلة بالحاقن الدقيق لحقن تعليق الخلية السرطانية.
      ملاحظه: سيختلف ضغط الحقن والوقت بناء على حجم تجويف الإبرة ، ولكن نقطة البداية الجيدة هي 5-10 رطل لكل بوصة مربعة و 50-100 مللي ثانية. يمكن تقييم حجم الخلايا السرطانية المحقونة باستخدام تقنيات قطرة الزيت القياسية من خلال الحقن في الزيوت المعدنية ، إذا رغبت في ذلك. عادة ما تعطي حقن 500 لتر بقطر قطرة 0.1 مم أفضل النتائج.
4. اشطف الأجنة المحقونة برفق من لوحة الحقن وفي طبق بتري باستخدام ماء البيض العذب (0.6 جم / لتر ملح حوض السمك في ماء التناضح العكسي + 0.01 مجم / لتر أزرق الميثيلين). احتفظ بالأجنة في ماء البيض للإجراءات المتبقية أو حتى تنمو في خزانات.
5. افحص الأجنة المحقونة تحت مجهر مجسم فلوري. تأكد من أن ضغط الحقن والزاوية وحجم الإبرة ولزوجة تعليق الخلية تؤدي إلى ملء الخلايا السرطانية 25-50٪ من مساحة البطين. اضبط هذه المعلمات حسب الضرورة.
6. كرر الخطوات من 1.1 إلى 1.5 لأي أجنة متبقية. تخدير الأجنة الإضافية حسب الحاجة.
   ملاحظه: يمكن للمستخدم المتمرس حقن ما يصل إلى 300 جنين على مدى 3-4 ساعات.
7. ضع الأجنة مرة أخرى في حاضنة 28 درجة مئوية طوال الليل.
8. في اليوم التالي ، قم بتقييم بقاء الجنين من خلال فحص السمات المورفولوجية والفسيولوجية ، مثل النمو الطبيعي للقلب والدماغ ، كما هو موضح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماء البيض في المنزل الحفاظ على الأجنة ، وصنع لوحة الحقن طبق بتري ثيرمو فيشر FB0875711Z إسكان الأجنة ، مما يجعل لوحة الحقن حاوية زجاجية أي علامة تجارية صنع لوحة الحقن الماصات الدقيقة أي علامة تجارية إعادة تعليق الورم وزرعه مسبار بزاوية أدوات العلوم الدقيقة 10140-02 التلاعب بالجنين نقل الماصة أي علامة تجارية التلاعب بالجنين مجهر مجسمة أوليمبوس ش.ز61 زرع الورم المجهر المجسم الفلوري أوليمبوس SZX16 تصوير عمليات زرع الورم كاميرا مجهر أوليمبوس موانئ دبي 72 تصوير عمليات زرع الورم حاضنه أي علامة تجارية الحفاظ على الأجنة ، تسخين لوحة الحقن N2 أي علامة تجارية تجارية لإعداد الحاقن الدقيق الشعيرات الدموية الزجاجية (بدون خيوط) أدوات الدقة العالمية TW120-4 زرع الورم مجتذب إبرة أدوات سوتر ف-97 زرع الورم نصائح Microloader إيبندورف 930001007 زرع الورم حاقن دقيق جهاز هارفارد بلي -90 زرع الورم التريكايين إس (MS-222) ويسترن كيماويات تي آر إس 1 زرع الورم ، مخدر أغاروز دينفيل CA3510-8 صنع لوحة الحقن المايكرويف أي علامة تجارية صنع لوحة الحقن مِيزَان أي علامة تجارية صنع لوحة الحقن القفازات أي علامة تجارية جميع جوانب البروتوكول بروناز تشخيص روش 11459643001 الأجنة dechorionate شفرة الحلاقة ثيرمو فيشر 12640 [م] تحضير الإبرة دورق 50 مل (قطر 2 بوصة) أي علامة تجارية صنع لوحة الحقن حاوية زجاجية أي علامة تجارية صنع لوحة الحقن الميثيلين الأزرق سيجما ألدريتش M9140 أضف إلى ماء البيض لمنع نمو الفطريات